《Biochimie》：A Single Intra-articular Injection of IDO-Gal3 Shifts Synovial Fluid Metabolic Profiles for up to Six Weeks in Male Rats with Knee Instability
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骨关节炎治疗中，单次关节内注射IDO-Gal3融合蛋白可改善大鼠痛觉行为并长期调控滑液代谢谱，抑制色氨酸代谢相关通路，同时下调胶原代谢相关氨基酸通路，但未显著影响关节软骨面积和骨微结构。
Folly M. Patterson | Carlos J. Cruz | Brittany D. Partain | Hope Welhaven | Estefania Urrego Hernández | Austen Breland | Jacob L. Griffith | Arun Wanchoo | Jonathan O. Cooper | Joshua F. Yarrow | Ronald K. June | Benjamin G. Keselowsky | Gregory A. Hudalla | Kyle D. Allen
J. Crayton Pruitt 生物医学工程系，佛罗里达大学，1275 Center Dr, JG56, Gainesville, FL, 32610, 美国
摘要
联合代谢是治疗骨关节炎的潜在靶点。我们之前开发了一种吲哚胺2,3-双加氧酶与半乳凝集素-3（IDO-Gal3）的融合蛋白，旨在将色氨酸代谢途径转向犬尿氨酸途径。在这里，我们假设关节内的IDO-Gal3可以通过测量疼痛行为、滑液代谢物谱和关节结构来防止雄性大鼠的骨关节炎进展。通过切断内侧副韧带和完全或部分切断内侧半月板来诱导关节退化。3-4天后通过单次关节内注射给予IDO-Gal3。在第一组Sprague Dawley大鼠中，与生理盐水（对照组）相比，IDO-Gal3处理后四周时内侧胫骨平台软骨面积增加。四周时，后爪缩回阈值也高于对照组。在第二组Lewis大鼠中，通过LC-MS测量的滑液代谢组谱在IDO-Gal3处理的一周和六周时发生了变化。一周时，IDO-Gal3处理动物的色氨酸代谢途径发生了改变。六周时，参与胶原蛋白更新的氨基酸途径（如精氨酸和脯氨酸）在IDO-Gal3处理的大鼠中下调。能量代谢途径也表现出类似的趋势。六周时，内侧胫骨平台软骨面积和骨小梁骨面积没有变化，这可能与部分切断内侧半月板有关。总之，单次关节内注射IDO-Gal3改善了触觉敏感性，并导致滑液代谢谱的短期和长期变化。
引言
异常的关节代谢已成为膝关节骨关节炎（OA）的一个显著特征，因为越来越多的证据表明代谢失调与OA之间存在关联[1]、[2]。关节中的代谢有助于调节分解代谢和合成代谢过程；在OA发病过程中，这些过程会失去平衡。在OA关节中，免疫细胞在软骨破坏后产生促炎细胞因子和分解代谢介质，这会破坏关节稳态，导致软骨降解和骨骼的适应性重塑[3]。软骨破坏产物进一步刺激滑膜免疫细胞，继续OA中的关节损伤循环并导致慢性疼痛[3]。目前的关节内治疗主要通过甾体和非甾体抗炎药来缓解症状，但这些治疗只能提供暂时的疼痛缓解，并不能改变OA的进展[4]。因此，有可能通过靶向关节水平的代谢变化来改变OA的病程。
吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO）是将色氨酸代谢转化为犬尿氨酸生产过程中的限速酶。先前的临床前研究发现，在前交叉韧带断裂[5]和胶原诱导的关节炎模型[6]中，血清中的犬尿氨酸水平降低。其他研究也表明，IDO抑制会加速胶原诱导的关节炎[7]。在患有腕部OA的马匹的滑液中，色氨酸水平升高而犬尿氨酸水平降低[8]。临床上，犬尿氨酸途径的下游代谢物犬尿酸和黄尿酸在类风湿性关节炎患者的血清中水平降低，其浓度与生活质量评分呈负相关[9]。综上所述，将色氨酸转化为犬尿氨酸及其衍生物具有治疗OA的潜力。
与此相关的是，我们制备了一种与半乳凝集素-3（Gal3）结合的IDO形式，Gal3是一种细胞外基质锚定蛋白。IDO和Gal3的这种融合（IDO-Gal3）增加了IDO在关节中的停留时间，并延长了IDO的代谢重编程效果。之前我们发现，在OA进展确立后进行关节内注射IDO-Gal3可以降低大鼠OA模型中的触觉敏感性，并减少滑液中的白细胞介素-6浓度[10]。此外，IDO-Gal3还改善了其他炎症性疾病的症状[11]。然而，这些研究并未确定IDO-Gal3是如何改变局部关节代谢的。在这里，我们假设单次预防性注射IDO-Gal3可以改变滑液代谢组谱，从而防止因关节损伤引起的行为和关节结构变化。虽然本研究的目的是评估IDO-Gal3在OA模型中的治疗效果，但所用模型中通常不会出现严重的软骨退化和骨损伤；因此，我们将所有结果解释为轻度关节不稳定和轻度关节损伤的情况。
动物
所有程序均获得了佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会的批准。研究1使用了10-14周大的Sprague-Dawley雄性大鼠，研究开始时的体重为524 ± 19克（Charles River公司，马萨诸塞州威尔明顿）。大鼠被置于12小时倒班光照周期下，以增加白天的活动量，以便收集步态数据。研究2使用了12周大的Lewis雄性大鼠，研究开始时的体重为313 ± 6克（Charles River公司）。
研究1：四周时的定量组织学
图1显示了代表性的组织学图像。手术后四周，IDO-Gal3处理组和生理盐水处理组的软骨表面损伤均最小。根据OARSI组织病理学评分系统评估的软骨损伤在两组之间没有显著差异（处理主效应，p = 0.81），而手术本身有显著影响（肢体主效应，p = 0.01；见补充图2）。每组中有4只动物的OARSI评分为0或1，表明
讨论
本研究的目的是评估预防性关节内注射IDO-Gal3是否可以改变膝关节损伤大鼠模型中的疼痛行为和滑液代谢谱。这一目标是基于之前评估IDO-Gal3治疗已确诊OA的研究[10]得出的。这里的数据表明，单次注射IDO-Gal3在损伤后四周内逆转了触觉敏感性，且没有改变步态代偿。在研究1中，IDO-Gal3处理后内侧胫骨软骨面积增加
结论
在这项研究中，我们在膝关节不稳定的大鼠模型中评估了预防性IDO-Gal3的效果。我们发现，单次注射IDO-Gal3可以逆转触觉敏感性，且不会改变步态特征。该治疗还急性改变了滑液中的多个代谢途径，包括色氨酸代谢，并长期改变了滑液的整体代谢谱。局限性在于，许多动物的内侧半月板完全切断未能成功实现，因此尚不清楚预防性IDO-Gal3是否
CRediT作者贡献声明
Jacob L. Griffith：软件开发、实验研究。Austen Breland：软件开发、实验研究。Ronald K. June：写作、审稿与编辑、监督、资源协调、概念构思。Joshua Yarrow：写作、审稿与编辑、监督。Jonathan O. Cooper：正式分析。Arun Wanchoo：初稿撰写、资源协调、方法学设计。Hope Welhaven：初稿撰写、实验研究、正式分析。Kyle D. Allen：写作、审稿与编辑、监督、项目管理、资金协调
数据和材料的可用性
支持本研究结果的数据可向相应作者Kyle D. Allen索取。
资金来源
NIH/国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（资助编号#R01AR079874）；NIH/国家老龄化研究所（资助编号#T32AG049673）；NIH/NIAMS（资助补充编号#3UC2AR082196-S2）；NIH/NIAMS（资助补充编号#R01AR071431-S1）；佛罗里达大学 Herbert Wertheim工程学院；J. Crayton Pruitt生物医学工程系；研究与开发办公室，退伍军人事务部（VA）设备资助编号#1IS1BX006057-01）。利益冲突声明
佛罗里达大学拥有与本文报道的分子及其用途相关的待批专利。Ronald K. June是OpenBioworks的联合创始人，但未参与本研究。Brittany D. Partain在研究完成前就职于Exagen公司，Jacob L. Griffith在研究完成后来到Medtronic公司工作。Exagen公司和Medtronic均未参与本研究。
致谢
Folly M. Patterson得到了NIH/国家老龄化研究所（资助编号#T32AG049673）和NIAMS（资助补充编号#3UC2AR082196-S2）的支持。Carlos J. Cruz得到了NIH/NIAMS（资助补充编号#R01AR071431-S1）的支持，以及佛罗里达大学 Herbert Wertheim工程学院和J. Crayton Pruitt生物医学工程系提供的奖学金。本研究使用的蒙大拿州立大学质谱设施（RRID: SCR_012482）的资金也得到了支持。
