《Biomaterials Advances》：Bioengineered baculovirus-derived extracellular vesicles loaded with of γ-carboxylated Gla-rich protein: Dual modulation of inflammation and vascular calcification
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慢性炎症与异位钙化是驱动心血管疾病、慢性肾病等重大慢性炎症性疾病的关键相互关联过程。Gla丰富蛋白(GRP)作为一种具有双重抗炎与抗钙化特性的维生素K依赖性蛋白，是极具前景的治疗分子，但其生物医学应用受限于γ-羧化形式(cGRP)的生产困难及其在生理pH下的低溶解度。研究人员开发了杆状病毒表达载体系统，将GRP的翻译后成熟过程与其在胞外囊泡中的分泌相耦合。他们构建了共表达GRP、γ-谷氨酰羧化酶、维生素K环氧化物还原酶和蛋白酶Furin的工程化昆虫细胞平台，成功实现了成熟cGRP的高效γ-羧化、前肽去除及分泌。从细胞培养上清分离的囊泡表现出与哺乳动物EVs相似的物理和分子特征，并负载了GRP。功能实验表明，所得的EVs能与人类THP-1巨噬细胞和血管平滑肌细胞结合而无细胞毒性，并能减少促炎细胞因子释放，同时发挥抗炎和抗矿化双重功效。该研究建立了首个能够生成功能性γ-羧化GRP及其囊泡制剂的生物工程平台，为维生素K依赖性蛋白研究和治疗性生物材料开发提供了双重创新。
在人体这台精密的“机器”中，血管的“硬化”与“炎症”常常携手作乱，是心血管疾病、慢性肾病等众多慢性疾病的幕后推手。这两个看似独立的过程，实际上像一对“难兄难弟”，相互促进，形成恶性循环。其中，一种名为Gla丰富蛋白的特殊分子引起了科学家的高度关注。它是一种维生素K依赖性蛋白，拥有既能“灭火”（抗炎）又能“防锈”（抑制异常钙化）的双重本领，被视为对抗这些疾病的“潜力股”。然而，这颗“潜力股”的成药之路却布满荆棘：它在生理环境下溶解度极低，难以制成稳定制剂；更重要的是，其完全活性高度依赖于一种名为γ-羧化的精密化学修饰，而常规的生物技术平台难以高效、大量地生产这种修饰完全的蛋白。这就像得到了一把设计精良的钥匙（GRP），却无法给它开刃（γ-羧化），也无法给它配一个合适的钥匙包（递送载体），使其难以打开疾病之锁。
为了破解这一困局，一个由Carla Viegas、Simon Pichard等人领衔的国际研究团队独辟蹊径，将目光投向了生物制造领域的“明星工具”——杆状病毒-昆虫细胞表达系统。他们设想，能否像“特洛伊木马”一样，利用昆虫细胞这座“工厂”，不仅生产出开好刃的钥匙（γ-羧化GRP），还顺便把它装进细胞自然分泌的“纳米快递小车”（胞外囊泡）里，实现“生产-包装-递送”一站式服务？他们的研究成果以“Bioengineered baculovirus-derived extracellular vesicles loaded with γ-carboxylated Gla-rich protein: Dual modulation of inflammation and vascular calcification”为题，发表在《Biomaterials Advances》上，为我们展示了这一巧妙策略的成功。
研究人员运用了几个关键技术方法来验证他们的设想。首先，他们采用了杆状病毒表达载体系统，这是一种在昆虫细胞中高效生产重组蛋白的成熟平台。他们通过基因工程手段，构建了能同时表达GRP、以及负责其加工成熟的三个关键酶（γ-谷氨酰羧化酶GGCX、维生素K环氧化物还原酶VKOR和蛋白酶Furin）的重组病毒。其次，他们利用差速超速离心技术从细胞培养上清中分离出不同大小的胞外囊泡群体（30K和100K EVs）。接着，他们运用了纳米颗粒追踪分析、透射电子显微镜、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定和蛋白质组学等多种表征手段，全面分析了所获EVs的物理属性、分子组成及GRP的装载与修饰状态。最后，在功能验证层面，他们使用了人源THP-1巨噬细胞和人原代血管平滑肌细胞作为模型，通过检测细胞活力、促炎细胞因子（如TNF-α, IL-6）释放以及细胞钙沉积等指标，系统评估了GRP-EVs的抗炎与抗钙化生物活性。
研究结果
1. 开发杆状病毒表达载体系统以实现人Gla丰富蛋白的翻译后成熟
研究人员成功构建了能共表达GRP、GGCX、VKOR和Furin的杆状病毒系统。实验证明，只有在共表达GGCX和VKOR并补充维生素K的条件下，分泌的GRP才能被γ-羧化特异性抗体识别，表明该系统能有效产生γ-羧化GRP。同时，Furin的表达对于切除GRP的前肽、生成成熟形式的蛋白至关重要。质谱分析进一步确认了不同加工阶段的GRP产物。
2. BEVS来源的胞外囊泡携带GRP货物并在钙化VSMCs中展现概念验证功能活性
研究发现，工程化昆虫细胞分泌的EVs中成功负载了GRP蛋白甚至其mRNA。将富含GRP的EVs与在矿化条件下培养的血管平滑肌细胞共孵育后，在细胞裂解液中检测到了GRP，表明EVs能将GRP递送至受体细胞。更重要的是，GRP-EVs处理显著降低了VSMCs的钙沉积，并下调了成骨关键转录因子RUNX2的表达，初步证明了其抗钙化功能。
3. GGCX/VKOR共表达和维生素K补充使GRP γ-羧化成为可能，而Furin介导前肽切割
通过将GRP与荧光蛋白mCherry融合以便追踪，研究人员进一步细化了各组分的作用。结果表明，GGCX和VKOR对于GRP的γ-羧化是必需的，而Furin则负责其前肽的有效切割。缺乏Furin或GGCX/VKOR中任一，都会导致GRP加工不完全或无法羧化。
4. BEVS释放的EVs的形态和分子表征
对分离的EVs进行详细表征发现，30K和100K EVs群体在粒径分布和蛋白质组学图谱上存在明显差异。纳米颗粒追踪分析和电镜显示它们主要是小于200纳米的囊泡。蛋白质组学分析鉴定出大量蛋白质，其中包含CD63、Flotillin-1、TSG101等数十个公认的EV标志蛋白，证实了所分离颗粒的胞外囊泡属性。
5. GRP优先与30K EVs相关，并在优化共表达条件下发生γ-羧化
定量分析揭示了一个有趣的现象：尽管100K EVs的总蛋白量和颗粒浓度更高，但GRP（无论是羧化还是非羧化形式）却更富集于30K EVs中。同时，共同表达的加工酶GGCX、VKOR和Furin也主要存在于30K EVs中。这提示30K EVs可能是GRP及其加工机器的特定载体。
6. GRP负载的EVs降低了THP-1来源巨噬细胞的促炎反应
在炎症模型中的应用显示，负载GRP的EVs能被THP-1巨噬细胞有效摄取，且在高浓度下未表现细胞毒性。当用脂多糖刺激巨噬细胞引发炎症时，预先用GRP-EVs（无论是羧化cGRP还是非羧化ucGRP）处理，能显著抑制促炎因子TNF-α的释放，展现了抗炎活性，且此活性对γ-羧化的依赖性相对较低。
7. γ-羧化和非羧化GRP负载的EVs对人VSMCs钙化和炎症的不同影响
在血管钙化模型中，GRP-EVs的双重功能得到进一步证实。它们能被VSMCs有效结合。功能上，cGRP-EVs和ucGRP-EVs均能抑制矿化条件下VSMCs的钙沉积，但cGRP-EVs的效果似乎更强，提示抗钙化功能更依赖于γ-羧化。同时，两种EVs也能降低矿化细胞分泌的IL-6水平，显示抗炎作用。而对照EVs（不含GRP）则无此效果。
结论与意义
该研究成功建立了一个创新的杆状病毒/昆虫细胞生物工程平台。这个平台的强大之处在于“一举两得”：它不仅能高效生产出经过正确翻译后修饰（γ-羧化和前肽切割）的、具有完全生物活性的Gla丰富蛋白，还能巧妙地利用细胞自身的分泌机制，将活性蛋白包装进其天然分泌的胞外囊泡中，从而生成GRP富集的EVs。这种“自带包装”的EVs在疾病模型细胞中表现出优异的抗炎和抗血管钙化双重生物活性。
这项工作的意义重大。首先，它解决了维生素K依赖性蛋白生产中长期存在的γ-羧化效率低和规模化难的瓶颈问题，为GRP及其他类似蛋白的研究与开发提供了新的高效生产方案。其次，它创造性地将蛋白生产与EVs递送载体构建合二为一，所获得的GRP-EVs是一种天然来源的、生物相容性好的纳米材料，兼具“药物”和“递送系统”双重属性，为治疗血管钙化及相关炎症性疾病提供了全新的候选治疗策略。最后，该平台具有高度的可扩展性和通用性，有望应用于其他需要复杂修饰的治疗性蛋白的生产与递送，在生物材料学和再生医学领域展现出广阔的应用前景。
