在体外、体内和计算机模拟（in silico）条件下，对优化后的肼-腙类吲哚衍生物进行了研究，这些衍生物作为多效的乙酰胆碱酯酶（AChE）、β-淀粉样蛋白酶1（BACE1）和单胺氧化酶B（MAO-B）抑制剂，可用于阿尔茨海默病的治疗

《Bioorganic Chemistry》：In vitro, in vivo, and in silico profiling of optimized hydrazide-hydrazone indole congeners as multi-faceted AChE, BACE1, and MAO-B inhibitors for Alzheimer's disease therapy

阿尔茨海默病多靶点治疗药物研究：通过引入甘氨酰基团优化indole-phenacetamide衍生物，新型化合物3c、3f、3k在体外显著抑制AChE、BChE、BACE-1、MAO-A、MAO-B及COX-2，体内实验显示抗炎活性及改善空间记忆效果，分子对接和动态模拟证实其与酶活性位点的稳定结合。

　　

Mona F. Said | Riham A. El Sheikh | Walaa Wadie | Enas A. Abd El-Haleim | Hend A. Hamuda | Haidy H. El-Zoheiry

开罗大学药学院药物化学系，埃及开罗11562

摘要

现有证据表明，阿尔茨海默病（AD）的特征是两种相互关联的病理变化。第一种涉及神经化学物质的下调，而第二种则包括更广泛的神经病理学变化。这些发现共同强调了需要采取多方面的治疗策略，例如多靶点导向配体（MTDLs）。

在本研究中，基于肼-腙结构的衍生物3a-l和5a-c是从先前合成的化合物Ia-o通过合理优化得到的，旨在针对多种与AD相关的靶点。通过将甘氨酸片段引入吲哚骨架的肼基链中来实现结构延伸。新的衍生物经过一系列生物学评估，以确定最具潜力的候选物。

初步的体外筛选显示，化合物3c、3f和3k对乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的抑制率均超过80%。进一步的体外研究证实了它们对其他与AD相关的酶（包括AChE、BChE、BACE-1、MAO-A、MAO-B和COX-2）的抑制作用。在体内评估中，所有合成的衍生物在卡拉胶诱导的大鼠足部水肿模型中表现出显著的抗炎活性。此外，化合物3c、3f和3k显著改善了患病小鼠的空间记忆能力，并显著缓解了AD的典型症状及相关组织病理变化。

为了深入了解其作用机制，对这些衍生物进行了计算机模拟（in silico）分析，分子对接结果显示它们在AChE、BACE-1和MAO-B活性位点上的结合模式较为理想。其中，化合物3f在各种生物检测和计算研究中表现最为一致，并通过分子动力学模拟进一步证实了其在三个酶结合位点上的稳定性。

总之，这种结构延伸策略成功生成了一类具有多重酶抑制活性的多靶点导向配体（MTDLs），显示出作为抗AD治疗药物的潜力。

引言

在阿尔茨海默病（AD）的发病机制中，病理过程和信号通路构成了一个复杂且多方面的生物学机制，使得其发病机制非常难以解析。[1],[2] 对AD患者大脑的研究发现，病理变化主要体现在两个层面：首先是关键神经递质系统的严重神经化学失调[3],[4]；其次是蛋白质聚集、神经炎症和氧化损伤等典型的神经病理学改变[5],[6]。

在神经化学失调方面，基底前脑胆碱能神经元的退化导致乙酰胆碱（ACh）水平显著下降，同时乙酰胆碱酯酶（AChE）和丁酰胆碱酯酶（BChE）的活性增加，进一步损害了突触传递和记忆功能[7],[8]。与此同时，星形胶质细胞中的单胺氧化酶B（MAO-B）活性增强，加速了多胺（如多巴胺和血清素）的代谢，同时产生过多的过氧化氢和其他活性氧物质，从而加剧了氧化应激[9],[10],[11]。此外，激活的胶质细胞中环氧化酶（COX），尤其是COX-2的表达增加，通过前列腺素的合成放大了神经炎症级联反应，进一步加剧了神经化学失衡[12],[13],[14]。

另一方面，神经病理学变化包括β-淀粉样蛋白（Aβ）斑块的沉积，这会破坏突触信号传导并引发神经炎症；tau蛋白的过度磷酸化导致神经纤维缠结（NFTs）、微管不稳定以及轴突运输障碍[15],[16]。

值得注意的是，AD的发病机制不仅仅由这些因素决定。神经化学失调和神经病理学变化之间存在双向且相互强化的循环，持续推动疾病的进展[17],[18]。例如，Aβ的积累和NFTs不仅对神经元造成结构损伤，还破坏了胆碱能信号传导并改变了单胺代谢，进一步加深了神经递质的缺乏[19],[20]。反过来，ACh水平的降低、MAO活性的增加以及COX介导的炎症会加剧氧化应激和炎症反应，从而进一步促进Aβ的沉积和NFTs的形成[21]。

鉴于上述证据，开发多靶点导向（MTD）治疗药物对于AD来说是一种必要的而非可选的方法。我们之前的研究设计了一系列含有肼基结构Ia-o的吲哚-苯乙酰胺类化合物，作为针对AChE、BChE、BACE1以及神经炎症途径的MTD药物[17]（见图2）。在这些化合物中，Ia-c被证明是最具活性的衍生物[17]。吲哚和肼-腙结构被认为是重要的药效团，含有这些结构的衍生物已被证实具有多种显著的生物活性，包括抗AD作用[22],[23],[24],[25]。含有肼-腙基团的取代吲哚衍生物II和III对AChE和BChE具有双重抑制作用[26],[27]；基于褪黑素和多奈哌齐的衍生物IV显示出显著的AChE抑制作用并具有抗氧化特性[27]；其他肼-腙衍生物（V和VI）也被证明是强效的MAO-B抑制剂[28],[29]。

基于这些发现，本研究将进一步优化这些结构，旨在增强它们对AChE和BACE1的抑制作用，同时具备MAO-B抑制潜力。作为我们早期研究的初步优化策略，我们在吲哚苯乙酰胺骨架的肼基链上引入了甘氨酸片段，生成了新的肼-腙衍生物3a-l。这一修饰预计将显著提高对AChE和BACE1的抑制效果。在设计化合物的两端，我们引入了具有交替电子性和亲脂性的芳香环，以研究其对生物活性的影响。此外，为了评估苯乙酰胺部分对整体活性的贡献，本研究还合成了仅含有肼-腙链而不含苯乙酰胺尾部的吲哚衍生物5a-c（见图1）。

关于AChE的抑制作用，先前的对接研究揭示了这些化合物在催化活性位点（CAS）和外围阴离子位点（PAS）之间的相互作用，同时也表明结构延伸有助于增强与CAS深层残基和PAS入口残基的结合。在此结构中，吲哚部分锚定在位点的中部，苯乙酰胺部分与PAS相互作用，而苯基甘氨酸肼基链深入CAS内部以实现最佳结合。

对于BACE1的结合，结构延伸有望使其能够与四个结合口袋及其相应的亚口袋相互作用。苯乙酰胺部分旨在靶向S1′和S2′亚口袋中的催化二聚体（Asp32/Asp228），而吲哚部分则锚定在S1口袋，并引导苯基甘氨酸肼基链朝向S1、S2和S3口袋。增加的柔韧性和长度也有助于与S4口袋的相互作用，从而增强结合亲和力和抑制效果。

根据我们设计选择性MAO-B抑制剂的策略，我们重点关注了MAO-B结合口袋的关键结构特征。MAO-B活性位点是一个延长的口袋，包含两个疏水区域（入口腔和底物腔），以及一个亲水芳香笼。底物腔主要由Tyr60、Tyr326和Gln206定义，而它与入口腔之间由一个由四个残基（Phe168、Leu171、Ile199和Tyr326）组成的柔性环区域分隔。芳香笼对于底物和抑制剂的识别至关重要，由FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）以及周围的芳香残基Tyr398和Tyr435构成。Tyr326和Ile199被认为是决定MAO-B选择性的关键残基[30]。因此，所设计的结构具有足够的长度，可以跨越活性位点，同时接触到入口腔、底物腔和芳香笼。吲哚核心预计会锚定在柔性环区域内，有效地将分子分为两个功能域。由于电子的离域作用，苯基甘氨酸肼基链具有更高的疏水性，预计会与入口腔和底物腔相互作用。相比之下，更极性的苯乙酰胺部分则与亲水芳香笼相互作用。

所有目标化合物首先在体内评估了其抗炎活性。随后进行了初步的体外筛选，以评估其对AChE和BChE的抑制作用，以选择最具活性的候选物进行进一步的全面体外评估，包括对AChE、BChE、BACE1、COX-2、MAO-A和MAO-B酶的作用。此外，选定的最活跃衍生物还在体内进行了评估，以研究它们对AD症状的影响并深入了解其作用机制。此外，还进行了计算机模拟（in silico）研究，包括分子对接和分子动力学模拟，以更深入地了解最具潜力化合物的结合模式。

化学

新吲哚苯乙酰胺类似物3a-l的合成过程见图1：首先将已知的吲哚-3-甲醛苯乙酰胺衍生物1a-d与适当的苯乙酰胺衍生物在干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中搅拌，并在碳酸钾的存在下反应得到[17],[31]；然后通过相应的苯胺与乙基反应制备了2-((4-氨基)乙酰肼衍生物2a-c[32]。

结论

在本研究中，我们从先前发表的衍生物Ia-o出发，对新的肼-腙衍生物3a-l和5a-c进行了结构优化，旨在同时调节与AD相关的多种病理途径。在新制备的衍生物中，化合物3c、3f和3k因其在AChE、BChE、BACE-1、MAO-B和COX-2酶上的体外抑制活性而脱颖而出。

实验

所有用于化学合成和验证化合物的仪器详细信息记录在补充材料中（补充数据，S1.1）。

化合物1a-d[17],[31]、2a-c[32],[33]、4[34]是按照先前报道的方法制备的。

CRediT作者贡献声明

Mona F. Said：撰写、审稿与编辑、项目监督、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构建。 Riham A. El Sheikh：数据可视化、方法学设计、数据分析。 Walaa Wadie：初稿撰写、项目监督、数据管理。 Enas A. Abd El-Haleim：方法学设计、实验研究、数据分析。 Hend A. Hamuda：方法学设计、实验研究、数据分析。 Haidy H. El-Zoheiry：撰写、审稿与编辑。