新型pH响应性抗癌脂肽通过智能的分子内电荷屏蔽和脂质化修饰机制，展现出卓越的抗肿瘤性能

《Bioorganic Chemistry》：Novel pH-responsive anticancer lipopeptide exhibiting superior antitumor performance by the smart intramolecular charge shielding and lipidation modification

抗肿瘤肽通过内源电荷屏蔽与脂质化修饰协同增强pH响应活性及选择性，降低毒性。1C6-KLHE新肽在体内外展现11.1倍高选择性和2倍杀肿瘤效果，通过pH激活膜破坏和细胞凋亡实现高效低毒治疗。

　　

田亚丽|王玉霞|刘林峰|吴凤展|毛瑞轩|王晶晶|冉凯欣|朱晶怡|巴祖芳|钟超|沟三湖|刘慧|张云|倪景曼

甘肃省新药临床前研究重点实验室药学院药剂学研究所，中国医学科学院基础医学科学学院肽科学研究单元，2019RU066，兰州大学，兰州730000，中国

摘要

pH响应型抗癌肽（ACPs）因具有更好的选择性和较低的毒性而受到越来越多的关注，成为新一代有前景的癌症治疗候选药物。开发有效的策略以提高pH响应型ACPs的治疗潜力对于促进其成功应用至关重要。本文提出了一种有趣的设计策略，通过结合分子内电荷屏蔽和脂质化修饰来提高pH响应型ACPs的抗癌效果，同时保持低毒性。基于富含组氨酸的肽L7H7，设计并合成了一系列新的短pH响应型ACPs。结果表明，分子内电荷屏蔽肽KLHE比L7H7具有更高的pH激活杀伤效应和选择性指数。值得注意的是，这些智能共修饰肽能够更好地提高pH激活的抗癌活性并降低pH响应型ACPs的毒性。其中，从最佳位置衍生出的新pH响应型脂肽¹C6-KLHE表现出优异的pH依赖性抗癌活性（增加了2倍），同时显著提高了治疗选择性（增加了11.1倍），并且血清稳定性提高了4.03倍。酸激活后，¹C6-KLHE通过pH依赖性的膜破坏和细胞凋亡发挥抗癌作用。此外，新肽¹C6-KLHE在体内的抗癌效果和毒性均优于KLHE和PTX，显示出其在体内应用的明显优势。总之，我们的工作表明，分子内电荷屏蔽和脂质化修饰的智能结合是开发具有更好肿瘤治疗潜力的pH响应型ACPs的有效方法。

引言

尽管现代肿瘤学取得了显著进展，癌症仍然是全球主要的死亡原因之一[1]，[2]。目前，传统的临床治疗方法主要包括化疗、放疗、免疫疗法和手术治疗，其中化疗仍然是最常用的治疗策略[3]，[4]。然而，由于非特异性细胞毒性和多药耐药性（MDR）的发展[5]，[6]，这些方法的效果有限。因此，开发具有更好选择性和高效率的新抗癌药物具有重要意义。

抗癌肽（ACPs）因其优异的生物相容性、低免疫原性、低药物耐药性以及易于合成和修饰而成为传统化疗的有希望的替代品[7]，[8]，[9]。研究表明，ACPs具有一些共同的结构特征，如正电荷和疏水性，这些特征在它们的生物活性中起着关键作用[10]，[11]，[12]，[13]。它们可以吸附并结合到癌细胞膜上，并通过独特的膜破坏或细胞内机制发挥广谱抗癌作用[10]，[11]，[12]，[13]。特别是，不可逆的膜扰动使ACPs比其他抗癌剂更不易产生耐药性[14]，[15]。然而，由于ACPs在较高浓度下会对正常细胞造成损伤以及在体内的稳定性较差[16]，[17]，其作为新型抗癌候选药物的临床应用受到了很大限制。

为了提高它们的前景，人们尝试了多种有效的设计策略来优化和开发新的有前景的ACPs，包括氨基酸修饰[18]，[19]，[20]， conjugation或stapling[21]，[22]，[23]，[24]，纳米颗粒[25]，[26]，以及肿瘤微环境响应性设计[27]，[28]等。在这些策略中，基于酸性肿瘤微环境的pH激活型ACPs设计已被证明是一种有效的方法，可以提高ACPs的选择性[29]，[30]，[31]。阳离子ACPs与阴离子肿瘤膜之间的静电吸引是强膜结合和破坏的关键力量[10]，[11]，[12]，[13]。pH触发的ACPs可以实现pH响应性的电荷转换，从而有效调节静电吸引并提高ACPs的肿瘤选择性[29]，[30]，[31]，[32]。组氨酸是一种独特的氨基酸，含有咪唑环，在正常pH下可以保持未质子化状态，但在酸性pH下会质子化成带正电荷的状态[33]，[34]，[35]，[36]，[37]。因此，设计了富含组氨酸的ACPs以减轻正常条件下的非选择性静电吸引；而在酸性pH下，它们的膜结合和破坏能力得到恢复，表现出酸激活的抗癌活性和更好的特异性。例如，pH响应肽[D]-H6L9在生理pH下保持不活跃状态，但在酸性环境中由于组氨酸残基的质子化而表现出选择性的肿瘤杀伤作用[31]。此外，我们之前设计的新组氨酸基肽（LH系列）也表现出显著的pH响应性[38]，[39]。然而，这些pH激活型ACPs总是在提高选择性的同时减弱了抗癌效果。因此，我们期待一种新的方法来增强pH响应型ACPs的杀伤效果，同时保持最低的毒性。

先前的研究表明，通过引入His、Lys和Glu残基进行分子内电荷屏蔽可以有效地控制pH触发的静电相互作用并调节适当的疏水性，这对提高pH响应型ACPs的抗癌性能具有积极作用，尤其是大大降低了肽的毒性[40]。然而，仍有很大的空间来进一步提高它们的抗癌效力以实现成功应用。值得注意的是，使用脂肪酸已被证明可以显著增强ACPs的抗癌活性，它们可以提供足够的疏水性以促进膜相互作用[41]，[42]，[43]。然而，包含脂肪酸通常容易导致肽的毒性增加，不幸的是，这会降低ACPs的选择性，因为高疏水性和强烈的膜破坏[41]，[42]，[43]。因此，结合分子内电荷屏蔽设计和脂质化修饰可能有助于调节pH响应型ACPs的抗癌活性和毒性，最终在不增加毒性的情况下增强它们的抗癌效力。

在本研究中，基于富含组氨酸的肽L7H7（LHHLLHLLHHLLHH?NH₂）[38]，通过结合分子内电荷屏蔽和脂质化策略，设计了一系列新的pH响应型ACPs，旨在开发高效且安全的新型ACPs（图1）。这些新的肽类似物包含两个关键的结构单元：（1）通过将K和E引入L7H7的N端和第3位点，分别进行分子内电荷屏蔽设计[38]，[39]，[40]，以优化新肽的抗癌性能。此外，还选择了k和e来探索它们的D-氨基酸对新肽抗癌效果的影响。（2）将不同链长的脂肪酸（C6、C12和C18）引入新肽序列的N端，并研究了不同脂肪酸链对新pH响应型ACPs的活性和细胞毒性的影响。同时合成了相应的对照脂肽C6/C12/C18-L7H7进行比较分析。此外，考虑到α-螺旋两亲界面在ACPs活性优化中的关键作用，将理想的脂肪酸C6策略性地定位在新肽的两亲界面的ε-氨基上，以系统评估C6的不同修饰位置对新肽的抗癌活性和毒性的影响[21]，[41]。因此，进一步设计了¹C6-KLHE、⁸C6-KLHE、¹⁵C6-KLHE、⁷C6-KLHE和¹⁴C6-KLHE，并对新pH响应肽的pH依赖性抗癌效应和细胞毒性进行了初步评估。分析了新肽的结构-活性关系。随后，还系统研究了新肽的稳定性、时间-杀伤动力学、抗癌机制以及体内的疗效和安全性。这项研究为开发高效且低毒性的新pH响应型ACPs提供了非常有价值的策略。

新肽的合成与表征

所有新肽均通过电喷雾离子化质谱（ESI-MS）和分析型反相高效液相色谱（RP-HPLC）合成和鉴定。设计肽的序列和理化特性见表1。结果表明，这些新肽的测量分子量与其理论值一致，纯度大于95%，表明它们已成功合成。

结论

在这项研究中，通过引入分子内电荷屏蔽和脂质化修饰，设计了一系列新型的短pH响应型ACPs，以增强它们的抗癌效力同时保持低毒性。微妙的pH触发电荷转换和有利的疏水性是提高其疗效和降低毒性的决定性因素。在这些新肽中，新的短脂肽¹C6-KLHE表现出理想的pH依赖性抗癌特性

化学品和试剂

Fmoc-Rink-MBHA树脂购自河北诚成（中国）。Fmoc保护的氨基酸、O-苯并三唑-N,N,N,N'-四甲基铀六氟磷酸盐（HBTU）和1-羟基苯并三唑（HOBt）由GL Biochem（上海，中国）提供。Melittin、N,N-二异丙基乙胺（DIEA）、2,2,2-三氟乙醇（TFE）和三氟乙酸（TFA）均购自Macklin（上海，中国），碘化丙啶（PI）和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物

CRediT作者贡献声明

田亚丽：撰写 – 原始草稿、可视化、验证、研究、正式分析、数据管理。王玉霞：可视化、验证、研究、数据管理。刘林峰：验证、研究、数据管理。吴凤展：可视化、研究、数据管理。毛瑞轩：研究、正式分析。王晶晶：可视化、方法学、研究。冉凯欣：可视化、验证。朱晶怡：可视化、方法学。巴祖芳：方法学，

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（资助编号：82404438、82173678、81773564）、长江学者和创新研究团队计划（资助编号：IRT_15R27）、CAMS医学科学创新基金（CIFMS）（资助编号：2019-I2M-5-074、2021-I2M-3-001、2021-I2M-1-026、2022-I2M-2-002）的财政支持。我们还要感谢匿名审稿人的宝贵建议。