迈向高效表观遗传调节因子的发现：针对HDAC1和HDAC6的新型吲哚基衍生物的设计、合成、生物学评估及构效关系研究

《Bioorganic Chemistry》：Towards the discovery of potent epigenetic modulators: Design, synthesis, biological evaluation, and SAR investigation of novel indole-based derivatives targeting HDAC1 and HDAC6

靶向HDAC1/6的吲哚衍生物设计与抗增殖活性研究。通过结构优化和分子对接分析，合成的羟基胺和苯酰胺类化合物表现出对HDAC6（低纳米摩尔IC50）和HDAC1的高度选择性抑制，其中化合物18对HDAC6抑制活性优于SAHA 16倍，化合物23c则对HDAC1抑制更显著。初步筛选显示10种化合物在NCI-60细胞系中具有显著抗增殖活性，苯酰胺系列在纳米至低微摩尔水平呈现广谱细胞毒性，且在HCT-116癌细胞中抑制增殖的同时对WI-38正常细胞安全。研究为开发新型选择性HDAC抑制剂提供了结构-活性关系依据。

　　

Sarah Shawky | Tarek Erfan Ahmed | Hesham Haffez | Aya Sobhy | Sameh Soror | Maiy Jaballah | Nermin Samir | Maged Henary | Deena S. Lasheen

埃及开罗Ain Shams大学药学院药物化学系，Abassia，邮编11566。

摘要

组蛋白去乙酰化酶（HDACs）在肿瘤发生中起着关键的表观遗传调节作用。因此，针对HDACs成为癌症治疗的一种新兴策略。通过利用支架跳跃和结构优化策略，我们基于vorinostat（SAHA）和entinostat开发了十五种吲哚衍生物。这些化合物针对HDAC1和HDAC6异构体进行了评估，结果表明所有羟胺衍生物（15a–c、16a、16b、17和18）均表现出强效的HDAC1/6抑制活性，其中对HDAC6的抑制作用更显著，IC₅₀值在低纳摩尔范围内（1–12 nM），比SAHA高出2至16倍。相比之下，苯酰胺衍生物（23a–c、24、25和26）对HDAC1的抑制作用更明显。此外，HDAC异构体选择性分析显示18主要抑制HDAC6，而23c则更倾向于抑制HDAC1。对18和SAHA的分子对接比较结果也支持了这一发现。初步筛选显示，在10 μM浓度下，有十种化合物具有显著的抗增殖活性，值得进一步进行浓度-反应筛选。值得注意的是，苯酰胺类化合物在整个NCI-60细胞系中表现出强烈的细胞毒性，GI₅₀值在纳摩尔到低微摩尔范围内。对代表性羟胺和苯酰胺衍生物的机制研究表明，它们在HCT-116癌细胞中具有显著的抗增殖效果，并且对正常成纤维细胞（WI-38）的安全性良好。总之，这些发现强调了这些化合物通过抑制HDAC1/6在抗癌治疗中的潜在作用。

引言

表观遗传异常显著促进了癌症的多种特征[1]、[2]。表观遗传修饰可以影响染色质结构和DNA的可及性，从而影响DNA修复、复制和转录等关键细胞过程。在表观遗传机制中，组蛋白乙酰化在调节染色质结构和基因表达中起着关键作用。组蛋白乙酰化和去乙酰化之间的平衡由两种具有相反功能的酶控制：组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）[3]。 HDACs是一类从组蛋白的N-乙酰赖氨酸残基上去除乙酰基的酶，这使得DNA能够缠绕在组蛋白上。除了修饰组蛋白外，HDACs还作用于非组蛋白蛋白，从而影响多种生理和病理状态的调控[4]。HDACs的过表达会导致染色质结构更加紧密，从而导致基因沉默和转录抑制，特别是肿瘤抑制基因的沉默。此外，许多研究表明HDACs在肿瘤生长、细胞周期进展、自噬、血管生成、凋亡和药物耐药性中起着重要作用[5]、[6]、[7]。因此，HDACs已成为有前景的表观遗传治疗靶点，用于抗癌治疗。 在人类基因组中，已鉴定出18种HDAC异构体，它们被分为四类：I类（HDAC1、2、3和8）、IIa类（HDAC4、5、7和9）、IIb类（HDAC6和10）和III类（sirtuins 1–7）以及IV类（HDAC11）[8]。I类、II类和IV类HDACs依赖Zn²⁺作为金属蛋白，而III类HDACs需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺作为辅因子来催化去乙酰化反应[9]。I类HDACs，尤其是HDAC1和HDAC6（IIb类），已被证实参与多种癌症类型的致癌信号通路[10]、[11]、[12]、[13]。因此，针对这些异构体成为癌症治疗的可行策略。 经典的HDAC抑制剂药效团包含三个主要部分：一个占据HDAC活性口袋入口的表面识别基团（封端基团）、一个负责结合Zn²⁺的锌结合基团（ZBG），以及连接这两个结构域的碳氢链（脂肪族或芳香族连接剂）[14]。根据锌结合基团的不同，HDAC抑制剂可以分为羟胺类和非羟胺类抑制剂。羟胺类抑制剂是指含有羟胺基团的化合物，因其优异的金属螯合性能而受到关注；而非羟胺类抑制剂则包括其他类型的ZBG，如N-(2-氨基苯基)苯酰胺、硫醇、2-巯基乙酰胺、酰胺、酮、羧酸、肼、三氟甲基噁唑（TFMO）和氨基肟[15]、[16]。 迄今为止，已有五种HDAC抑制剂获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准（图1）。2006年，vorinostat（SAHA）成为首个被临床批准的用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）的羟胺类HDAC抑制剂。随后，基于硫醇的romidepsin被批准用于CTCL和周围T细胞淋巴瘤（PTCL），belinostat用于复发性或难治性PTCL，panobinostat用于多发性骨髓瘤（MM）。最近，givinostat被FDA批准用于治疗杜氏肌营养不良症（DMD）[17]。此外，中国食品药品监督管理局（CFDA）也批准了基于苯酰胺的tucidinostat用于复发性或难治性PTCL[18]。值得注意的是，大多数批准的HDAC抑制剂主要用于血液系统恶性肿瘤。因此，开发对实体瘤具有更强抑制力的HDAC抑制剂对于推进癌症治疗至关重要[19]。 由于非选择性抑制多种HDAC异构体导致的泛HDAC抑制活性常常伴随着不良副作用，包括骨髓抑制、腹泻、心律失常和其他毒性作用。因此，人们越来越关注开发具有类别或异构体选择性的HDAC抑制剂以减轻这些脱靶效应[20]。在临床试验中表现出较好选择性的HDAC抑制剂中，entinostat和ricolinostat分别对I类HDACs和HDAC6显示出显著的选择性。Entinostat（MS-275）是一种基于苯酰胺的I类选择性HDAC抑制剂，其IC₅₀值在低微摩尔范围内，目前正在临床试验中用于治疗晚期和难治性实体瘤或淋巴瘤[10]、[21]。Ricolinostat（ACY-1215）是一种口服可吸收的HDAC6选择性抑制剂，正在II期临床试验中作为单药或与硼替佐米联合治疗多发性骨髓瘤（MM），其对HDAC6的IC₅₀值约为5 nM，对I类HDACs的选择性约为10至12倍[22]。 鉴于提高HDAC抑制剂选择性的必要性，本研究旨在开发一系列具有优先HDAC抑制活性的化合物。通过采用支架跳跃和优化策略，我们设计并合成了三系列含有不同锌结合基团的吲哚衍生物，以研究这些羟胺类和非羟胺类化合物对HDAC 1和6异构体（分别代表I类和IIb类HDAC）的抑制作用和选择性。此外，本研究还旨在阐明这些化合物的构效关系及其生物学活性。此外，这些化合物还针对NCI-60细胞系（包括血液系统和实体瘤细胞系）进行了细胞毒性筛选。这一全面筛选旨在扩展HDAC抑制剂在两种类型肿瘤中的治疗应用，并比较HDAC1和HDAC6作为癌症治疗靶点的贡献。还对表现出抗增殖活性和显著HDAC1/6抑制活性的化合物在结肠癌HCT-116细胞系中进行了进一步的机制研究。

设计策略

受vorinostat（SAHA）和entinostat（MS-275）结构的启发，我们采用支架跳跃策略，用取代的吲哚基团替换了起始化合物的封端基团，以研究这种结构修改对HDAC抑制活性和选择性的影响。吲哚骨架在多种细胞毒性药物中已成为一种优选的结构基元；此外，

结论

在这项研究中，我们设计并合成了十五种含有羟胺或非羟胺ZBG的吲哚衍生物，包括N-(2-氨基苯基)苯酰胺和氨基肟，以研究它们通过靶向HDACs的细胞毒性潜力。体外HDAC抑制实验表明，羟胺类衍生物（15a–c、16a、b、17和18）表现出强效的HDAC1/6抑制活性，在10 μM浓度下抑制率为95–100%，IC₅₀值处于低纳摩尔范围。

化学

起始材料、试剂和溶剂购自Apollo Scientific（英国）、Sigma-Aldrich（德国）或Alfa Aesar（德国），无需进一步纯化即可使用。反应通过分析薄层色谱（TLC）进行监测，使用的是Merck公司提供的硅胶60 F₂₅₄，并在254 nm紫外光下可视化。纯化使用的是Merck公司提供的硅胶（230–400目）进行闪蒸柱色谱。

CRediT作者贡献声明

Sarah Shawky：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，软件使用，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理。 Tarek Erfan Ahmed：撰写 – 审稿与编辑，正式分析，数据管理。 Hesham Haffez：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，研究，正式分析，数据管理。 Aya Sobhy：验证，方法学，研究。 Sameh Soror：撰写 –

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了开罗Ain Shams大学ASU研究基金的财政支持。我们衷心感谢美国马里兰州国家癌症研究所对细胞毒性筛选工作的支持。同时，我们也感谢乔治亚州立大学化学系在¹³C NMR光谱分析、高分辨率质谱（HRMS）和HPLC纯度评估方面提供的宝贵帮助。