从绿藻Ulva ohnoi中提取的硫酸化多糖ulvan的降解菌——弧菌属（Vibrio）物种的完整基因组序列

《Microbiology Resource Announcements》：Complete genome sequences of Vibrio species, degraders of sulfated polysaccharide ulvan extracted from a green algae Ulva ohnoi

Vibrio sp.菌株基因组测序揭示ulvan降解机制及与Alteromonas差异。富集培养分离出KUL70、KUL78、KUL80三个菌株，全基因组测序显示均含PUL基因簇，但仅含短型ulvan lyase基因ullB和ullC，与含长型基因的Alteromonas不同。采用Illumina短读与MinION长读测序结合hybrid assembly，基因组完整度达99.12%-99.74%，通过比较PUL结构阐明Vibrio特异性降解途径。

　　

摘要

我们展示了能够降解藻类硫酸化多糖——岩藻聚糖（ulvan）的Vibrio属菌株的完整基因组序列。在所有能够利用岩藻聚糖的菌株中都发现了多糖利用位点（PULs）。通过比较Alteromonas和Vibrio中的PULs，可以阐明岩藻聚糖的降解途径。

公告

绿藻Ulva ohnoi在Ulva属物种中生长速度最快（1），这常常导致沿海海域出现绿色潮水（2）。U. ohnoi含有约35%的岩藻聚糖（3），这是一种复杂的水溶性硫酸化多糖，主要由L-鼠李糖-3-硫酸酯、葡萄糖醛酸和艾杜糖酸组成。岩藻聚糖及其降解产物寡岩藻聚糖可用于食品、饲料、生物医学、涂料和纺织等行业（4）。能够利用岩藻聚糖的细菌含有一个名为多糖利用位点（PUL）的基因簇，其中包含参与岩藻聚糖降解的基因（5）。

2022年8月，将U. ohnoi种植在陆基水产养殖设施中，并将其放入网箱中，在日本高知县Uranouchi湾（33.43°N, 133.42°E）放置了一周，作为诱饵基质以富集和捕获能够降解岩藻聚糖的细菌。回收的绿藻被放入含有40 mL高压灭菌人工海水的250-mL烧瓶中（Tetra Marin Salt Pro，Tetra Japan），海水中含有0.2%（重量/体积）的U. ohnoi岩藻聚糖作为唯一的碳源，然后在25°C下孵育2天。富集后的细胞被接种在含有0.2%（重量/体积）岩藻聚糖作为唯一碳源的人工海水琼脂培养基上，并在25°C下孵育两天。从中分离出的细菌再次在同一培养基上培养，最终选择了三个菌落。使用引物proR2（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和534R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）扩增了这些菌株的16S rDNA的V1–V3区域。扩增片段的核苷酸序列通过3130基因分析仪（Applied Biosystems）进行测定。所有三个菌株都属于Vibrio属。

使用Wizard HMW DNA提取试剂盒（Promega）从在Marine Broth 2216（Sigma-Aldrich）中培养过夜的细胞中提取基因组DNA。纯化的DNA（KUL70、KUL78和KUL80的浓度分别为78、79和126 ng/μL；使用QuantiFluor ONE dsDNA染料，Promega）用于短读长测序和长读长测序。对于短读长测序，基因组DNA被切割成150–350 bp的片段，并使用NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit（NEB）和NEBNext Multiplex Oligos（Illumina）构建文库。这些文库（浓度为20 pM）在Illumina MiSeq（MiSeq Reagent kit v3，150 cycles）上进行测序，生成75-bp的双端读取序列。使用MiSeq Reporter 2.6.2筛选出Phred编码质量分数大于30的适配子修剪后的读取序列。

对于长读长测序，使用1D Ligation Sequencing kit（SQK-LSK109；Oxford Nanopore Technologies）和Native Barcoding Expansion（EXP-NBD104）处理基因组DNA。这些文库在MinION（Flow Cell R9.4.1）上进行测序，无需进行尺寸筛选。使用MinKNOW version 22.05.5和集成的Dorado basecaller进行实时碱基调用。对于R9.4.1流式细胞，使用了fast basecalling模型（dna_r9.4.1_450bps_fast）。质量分数低于最低值的读取序列被标记为失败读取。

使用细菌基因组组装工具Trycycler v0.5.4（6）对长读长和短读长序列进行了混合组装。Trycycler使用TBLASTN在每个完成的复制子中搜索等位基因，并将序列环化（7）。使用CheckM v1.0.18（8）和特定谱系的工作流程（lineage_wf）评估基因组的完整性和污染情况。所有基因组组装都被系统发育地归类为Vibrio属，质量指标显示在表1中。基因注释使用DFAST原核基因组注释工具包v.1.6.0（9）完成。除非另有说明，所有软件均使用默认参数。

表1

表1 三种Vibrio菌株的特征

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菌株	登录号	基因组大小（bp）	完整性；	污染率（%）	GC含量（%）	CDSs、rRNAs和tRNAs的数量	生物项目；	生物样本	测序	DRA登录号	覆盖度（×）	MiSeq的读取数量	平均读取长度和质量；	中位读取长度和质量；	读取数量；	读取长度N50；	MinION的总碱基数
KUL70	AP045834	4,799,380	99.74	44.9	4,095	PRJDB35666	MiSeq	DRX686772	1,411,859	4,124.6, 10.0,
	AP045835 AP045836	0.98		40	132	SAMD01598106	MinION	DRX686769		2,811.0, 10.1, 140,062, 5,381, 和 577,705,068
KUL78	AP045837	5,989,974	98.82	46.0	5,510	PRJDB35666	MiSeq	DRX686773	517,147	4,204.8, 10.0,
	AP045838 AP045839 AP045840	3.76		31	112	SAMD01598107	MinION	DRX686770		2,791.0, 10.0, 57,996, 5,383, 和 243,862,671
KUL80	AP045841	5,712,820	99.12	46.1	5119	PRJDB35666	MiSeq	DRX686774	1,331,052	7,028.6, 10.0,
	AP045842 AP045843		3.06		34	117	SAMD01598108	MinION	DRX686771		3,580.0, 10.0, 32,925, 13,011, 和 231,417,115

测序基因组的特征列在表1中。与Alteromonas属物种（10）不同，后者在PUL中包含长型PL24家族岩藻聚糖裂解酶（ullA）、短型PL25岩藻聚糖裂解酶（ullB）和PL25岩藻聚糖裂解酶（ullC），这些菌株仅含有ullB和ullC基因。

致谢

本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科学研究资助（C类）项目（项目编号20K06054，资助对象为K.O.）的支持。