《Bioorganic Chemistry》：A rapid and selective phenothiazine-derived fluorescent probe for hypochlorous acid monitoring in living systems: from cellular imaging to in vivo systemic inflammatory response syndrome visualization
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本研究设计合成了一种基于ICT机制的新型小分子荧光探针QP，可快速（15秒内）、高灵敏度（4nM）检测HClO，在细胞和斑马鱼模型中验证其生物成像能力，并成功用于小鼠炎症反应（SIRS）的实时监测，为相关疾病诊断提供工具。
赛志鹏|张志飞|尤凯|徐静静|崔朝初|杨志军|葛春波
河南医科大学基础医学院法医学系，新乡453003，中国
摘要
次氯酸（HClO）是活性氧（ROS）家族中的关键成分，在免疫防御和细胞信号传导等生理过程中起着重要作用。然而，需要注意的是，过量的次氯酸产生与多种病理状态密切相关，包括炎症、神经退行性疾病和癌症。因此，开发能够实时、高选择性和灵敏地检测生物系统中HClO的工具对于深入了解其在生命过程中的机制以及促进相关疾病的早期诊断至关重要。本研究设计并合成了一种新型小分子荧光探针（E）-3-(2-(10-乙基-10H-吩噻嗪-3-基)乙烯基)-1-甲基喹啉-2(1H)-酮，该探针基于ICT机制。该探针具有快速响应时间（小于15秒）、高选择性和较大的斯托克斯位移（175纳米）。实验表明，这种探针能够在低至4纳摩的浓度下检测到HClO。在细胞实验和斑马鱼模型上的应用证实了其荧光成像能力，并且具有出色的生物安全性。这些发现为其在生物分析和生物传感领域的应用带来了良好前景。小鼠成像结果显示，HClO水平与全身炎症反应综合征（SIRS）的病理过程之间存在强烈相关性。这种探针有助于动态可视化SIRS的进展，并具有作为炎症相关疾病诊断工具的巨大潜力。
引言
在生物体的复杂微环境中，活性氧（ROS）作为关键的信号分子和效应分子，参与调节许多生理过程[1]、[2]。维持适当的ROS水平对于确保细胞功能正常至关重要。次氯酸（HClO）是ROS家族的重要成员，通过髓过氧化物酶（MPO）催化的过氧化氢和氯离子反应生成[3]、[4]、[5]。它是包括中性粒细胞和单核细胞在内的免疫细胞的组成部分，作为机体抵御病原微生物侵袭的主要化学防御机制[6]、[7]。在生理浓度下，HClO具有强大的氧化能力，能有效清除细菌、病毒和真菌，维持内部环境的稳定性[8]、[9]、[10]。然而，HClO的强氧化性质也使其成为一把双刃剑。在炎症或压力等病理刺激下，HClO的产生会增加。过量的HClO会攻击细胞内的生物分子，如蛋白质、核酸和脂质[10]、[11]、[12]、[13]，从而导致氧化应激损伤。这一过程与多种疾病的发病和进展密切相关。研究表明，异常升高的HClO浓度与动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、神经退行性疾病、药物性肝损伤（DILI）和癌症等多种病理过程密切相关[14]、[15]、[16]、[17]。此外，HClO水平的动态变化在疾病进展的调节中起着关键作用。因此，在生物系统中实时原位检测HClO对于阐明其生理和病理功能以及揭示相关疾病的机制具有重要的科学意义。此外，这还有助于为疾病的早期诊断和靶向治疗提供技术支持。
尽管传统的检测方法（包括滴定、电化学分析、高效液相色谱和化学发光）已被用于HClO的体外定量检测[18]、[19]、[20]、[21]、[22]，但这些方法受到操作繁琐、检测周期长和空间分辨率不足的严重限制，无法实现对复杂生物体内HClO动态的实时监测。相比之下，荧光探针技术因其高灵敏度、优异的选择性、出色的时空分辨率、易于操作和非侵入性的体内成像能力而成为生物活性小分子检测的研究热点[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]，为HClO在生物系统中的检测提供了强大而有力的平台。HClO特异性荧光探针通常基于HClO对识别基团（如C=C、C=N、C=S双键、硫化物和硒化物）的选择性氧化构建[29]、[30]、[31]、[32]、[33]，其发光行为主要涉及光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、荧光共振能量转移（FRET）和聚集诱导发射（AIE）[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。此外，通过合理的设计和修饰，可以有效地改善水溶性、生物相容性、响应速率和检测限等关键性能参数。
尽管近年来报道了许多次氯酸荧光探针，但一些关键缺陷仍限制了它们在复杂生物环境中的进一步应用。一些探针的选择性较差，容易受到其他活性氧、活性硫物种和类似生物分子的干扰[39]、[40]。大多数探针仅显示单通道荧光变化，这些变化容易受到探针浓度、光漂白和环境因素的影响，导致定量结果不理想。此外，许多探针的应用pH范围狭窄、抗干扰能力弱，在体内成像中的表现也不令人满意（表S1）。因此，设计和构建具有高选择性、高灵敏度和良好生物相容性的新荧光探针对于实际生物检测仍然非常必要。
在这里，我们合理开发了一种基于分子内电荷转移（ICT）的荧光探针QP，通过将喹啉和吩噻嗪基团结合而成。在探针QP中，吩噻嗪单元上的硫醚键（-S）可作为HClO的特异性识别位点，被氧化为相应的亚砜。该探针对次氯酸表现出优异的传感性能，具有超快响应时间（小于0.1分钟）、极低的检测限（4纳摩）、较大的斯托克斯位移（175纳米）、高灵敏度和宽的工作pH范围（3-11）。更重要的是，它在活细胞和斑马鱼中表现出出色的成像性能。更重要的是，它可以成功用于实时监测小鼠模型中全身炎症反应综合征（SIRS）的进展，为研究炎症机制和相关药物开发提供了有前景且可靠的工具。
材料与仪器
本研究使用的所有化学品均为分析级或光谱级，购自商业供应商（Bidepharm、Energy Chemical）。紫外吸收测量使用UV-2600分光光度计进行。荧光光谱使用Hitachi F-4700 FL分光光度计测量。氢和碳光谱的获取通过Bruker AVANCE NEO 400 MHz仪器完成。质谱数据收集使用Bruker micrOTOF-Q III质谱仪进行。
探针QP的设计与合成
吩噻嗪是一种优良的电子供体荧光团，用于构建基于分子内电荷转移（ICT）的荧光探针QP。该探针具有优异的光学性能、定制的识别特性和良好的生物相容性。QP的设计和合成路线如图1所示。QP的分子结构通过1H NMR（图S2）、13C NMR（图S3）和高分辨率质谱（HRMS）进行了表征。
结论
总之，我们开发了一种高性能荧光探针QP，使用吩噻嗪作为荧光团。QP探针对HClO具有高选择性和抗干扰性，响应时间快（0.1分钟），pH响应范围广（pH 4-11），斯托克斯位移大（175纳米）。此外，该探针具有低细胞毒性和良好的生物相容性。在细胞和斑马鱼模型实验中表现出优异的生物成像性能，充分验证了其
CRediT作者贡献声明
赛志鹏：撰写——原始草稿、项目管理、研究、资金获取。张志飞：撰写——原始草稿、验证、方法学、正式分析。尤凯：软件、方法学、研究、数据管理。徐静静：监督、软件、概念化。崔朝初：验证、方法学、研究。杨志军：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、资金获取。葛春波：撰写——审阅与编辑、撰写——原始稿。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了河南省自然科学基金（252300423182、252300421393）和河南医科大学研究生创新项目（YJSCX202526Y）以及河南省研究生教育改革与质量提升项目（YJS2026ZM07）的资助。
