68Ga标记的PEG修饰二聚体FAP放射性示踪剂的合理设计与临床前评估

《Bioorganic Chemistry》：Rational design and preclinical evaluation of 68Ga-labeled PEG-modified dimeric FAP radiotracers

靶向成纤维细胞激活蛋白（FAP）的[68Ga]Ga-HBEDFAP-H系列放射性示踪剂设计合成，通过调节PEG连接臂长度探究其对肿瘤摄取和药代动力学的影响。研究发现，三聚体（H3）在1小时呈现最高肿瘤摄取SUVmax 4.11±0.23，而四聚体（H4）虽肿瘤摄取降低至1.98±0.59，但显著减少肝肾积累，延长肿瘤滞留时间并提升对比度。相较于单聚体FAPI-04，H4具有更优的肿瘤靶向和滞留特性，验证了二聚化策略与PEG修饰协同优化FAP靶向示踪剂的可行性。

　　

李泽华|冯一豪|张宏瑞|王新林|李玉英|陈玉敏|崔梦超

教育部放射药物重点实验室，北京师范大学化学学院，北京 100875，中国

摘要

成纤维细胞活化蛋白（FAP）在癌相关成纤维细胞（CAFs）中高度过表达，而在正常成人组织中则表达极少，因此成为肿瘤成像和放射性核素治疗的理想靶点。在本研究中，我们设计并合成了一系列基于HBED-CC螯合骨架和UAMC-1110衍生的FAP结合基团的PEG修饰二聚体FAP靶向放射性示踪剂（[⁶⁸Ga]Ga-HBEDFAP-H1至[⁶⁸Ga]Ga-HBEDFAP-H4），旨在系统调节肿瘤摄取和体内药代动力学。在携带U87肿瘤的裸鼠中进行微PET/CT成像实验发现，体内行为显著依赖于PEG连接子的长度。在该系列中，[⁶⁸Ga]Ga-HBEDFAP-H3表现出最高的肿瘤摄取率（SUV_max = 4.11 ± 0.23，在注射后1小时），这突显了二聚体设计带来的强肿瘤靶向能力。进一步延长PEG连接子长度后得到[⁶⁸Ga]Ga-HBEDFAP-H4，其肿瘤摄取率有所降低（SUV_max = 1.98 ± 0.59，在注射后1小时），但肝脏和肾脏的积累显著减少，从而在后期时间点实现了更长的肿瘤滞留和更好的肿瘤与背景对比度。阻断实验确认了FAP的特异性肿瘤摄取。值得注意的是，与单体示踪剂[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04（SUV_max = 0.29 ± 0.11，在注射后1小时）相比，[⁶⁸Ga]Ga-HBEDFAP-H4的肿瘤摄取和滞留能力明显增强。总体而言，这些结果表明基于HBED-CC的二聚化策略结合合理的PEG化处理，有效提升了FAP靶向示踪剂的体内性能，为其在FAP导向治疗中的应用奠定了基础。

引言

肿瘤微环境（TME）因在肿瘤发生、进展、侵袭和治疗抵抗中的关键作用而受到肿瘤学界的日益关注。TME由非恶性成分组成，包括血管、免疫细胞、基质细胞和细胞外基质[1]、[2]。在这些成分中，癌相关成纤维细胞（CAFs）是许多实体瘤中主要的基质细胞群，是导致纤维化反应和TME重塑的关键驱动因素[3]、[4]、[5]、[6]。重要的是，CAFs介导的肿瘤促进作用在很大程度上独立于肿瘤基因型，这使得CAFs成为广泛肿瘤成像和治疗的理想靶点。

CAFs的一个标志性分子特征是成纤维细胞活化蛋白（FAP）的过表达，FAP是一种具有二肽酶和内肽酶活性的II型跨膜丝氨酸蛋白酶[7]、[8]、[9]。FAP在多种上皮恶性肿瘤的基质中异常且高度表达，而在正常成人组织中的表达量很低或可以忽略不计，仅在某些纤维化和炎症条件下略有上调[10]。这种高度差异性的表达模式使FAP成为诊断成像和靶向放射性核素治疗的理想分子靶点，过去十年间引发了大量研究兴趣[11]。

自UAMC-1110这一小分子抑制剂被发现以来，由于其高亲和力和选择性，它已成为大多数FAP靶向放射性配体的核心药效团[10]、[12]。基于这一骨架，Loktev及其同事率先开发出了第一个临床相关的FAP靶向放射性示踪剂[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-02，随后优化出了第二代示踪剂[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04和[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-46[7]。与[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-02相比，这些衍生物表现出更高的肿瘤摄取率、更快的非靶组织清除速度以及更好的成像对比度[13]。然而，这种药代动力学特性虽然赋予了[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04出色的诊断性能，但也导致其肿瘤清除迅速，限制了其在治疗中的应用，例如[¹⁷⁷Lu]Lu-FAPI-04。治疗剂需要长时间在肿瘤中滞留才能实现有效的放射传递[14]、[15]。这种药代动力学不匹配促使人们不断努力优化FAP靶向配体以实现真正的诊疗一体化应用[16]。

迄今为止，已探索多种策略来增强FAP靶向剂的肿瘤摄取和滞留，包括FAP抑制剂骨架的二聚化、结合白蛋白结合基团或共价靶向基团，以及连接聚乙二醇（PEG）链以调节亲水性和系统循环[8]、[16]、[17]、[18]、[19]。在这些方法中，基于二聚体FAP抑制剂的放射性配体显示出比单体对应物更高的肿瘤摄取率和更长的肿瘤滞留时间，这通常归因于其二价性。代表性例子包括[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-JNU、[⁶⁸Ga]Ga-DOTAGA.(SA.FAPi)₂、[⁶⁸Ga]Ga-DOTAGA.Glu.(FAPI)₂和[⁶⁸Ga]Ga-DO3A.Glu.(FAPi)₂（图1a）[16]、[20]、[21]。从结构上看，这些二聚体示踪剂可分为两类：一类使用squaramide（SA）基团作为FAPI单元和螯合剂之间的连接子，另一类使用氨基酸基连接子，最常见的是中心的L-谷氨酸（Glu）残基[16]、[22]、[23]。用Glu替换SA连接子被认为可以增强整体亲水性，从而加快非靶组织的清除速度并提高图像对比度[21]、[23]、[24]。

PEG化是另一种广泛采用的药代动力学优化策略，因为PEG链可以提高水溶性、延长系统循环时间、减少网状内皮系统的非特异性摄取，并减缓肾脏的快速清除[25]、[26]、[27]、[28]。近年来，PEG修饰越来越多地应用于FAP靶向放射性配体，以增强肿瘤摄取、延长肿瘤滞留时间和改善体内生物分布[29]。然而，PEG链长度对二聚体FAPI基放射性配体的药代动力学行为和肿瘤靶向性能的系统影响尚未得到全面研究。

在本研究中，我们基于HBED-CC（3,3′-(((ethane-1,2-diylbis((carboxymethyl)azanediyl))bis(methylene))bis(4-hydroxy-3,1-phenylene))dipropionic acid）骨架设计并合成了一系列新型二聚体FAP靶向放射性示踪剂，连接了不同长度的PEG链（图1b）。选择HBED-CC而非传统DOTA基螯合剂的主要原因是它能在温和条件下快速形成高度稳定的Ga³⁺复合物，并且在体外中也表现出优异的稳定性。此外，其两个末端羧基便于直接高效地构建二聚体结构。我们假设通过精细调节PEG基团可以精确调控药代动力学特性，从而增强肿瘤摄取和滞留时间，同时最小化非靶器官的积累。为了验证这一假设，我们对所得到的[⁶⁸Ga]标记的放射性示踪剂进行了系统评估：（1）体外 FAP结合亲和力评估；（2）在携带U87肿瘤的鼠体内的体内生物分布和药代动力学研究；（3）与临床常用的示踪剂[⁶⁸Ga]Ga-FAPI-04进行比较PET成像研究。通过这些综合评估，我们旨在阐明PEG链长度、肿瘤积累和药代动力学行为之间的关系，并为下一代具有诊疗潜力的二聚体FAP靶向放射性示踪剂建立合理的设 计原则。

部分内容摘录

化学

如方案1所述，建立了一种模块化合成策略，用于制备一系列基于HBED-CC的二聚体FAP靶向前体，这些前体具有不同类型和长度的连接子（L1–L4），从而能够系统研究连接子依赖性的药代动力学效应。合成从化合物1开始，其中酚羟基作为连接子安装的多功能位点。化合物2–5是通过1的碱促进O-烷基化获得的

结论

我们合理设计并评估了一系列基于HBED-CC螯合骨架的PEG修饰二聚体FAP靶向放射性示踪剂（HBEDFAP-H1–HBEDFAP-H4），以研究连接子结构对体内性能的影响。所有候选示踪剂均实现了高效的⁶⁸Ga标记，具有高RCY、优异的稳定性和保持的高FAP结合亲和力。通过系统调节PEG长度，获得了不同的药代动力学特征，从而可以直接评估肿瘤

一般信息

所有试剂和溶剂均为分析级，未经额外纯化即可使用。放射性标记实验使用无金属的HCl和NaOAc溶液。薄层色谱（TLC）在Silica gel 60 F254板上进行（Merck，德国），化合物在紫外光下可视化。粗产物使用FLEXA纯化系统（Bonna-Agela Technologies，中国）或SepaBean纯化系统（Santai Technologies，中国）进行纯化。最终化合物

作者贡献

M. Cui和Y.C.构思并设计了实验。Z. Li、Y. Feng、H. Zhang、X. Wang、Y. Li和Y. Chen进行了实验。Z. Li、Y. Chen和M. Cui分析了数据。Z. Li、Y. Chen和M. Cui撰写了论文。M. Cui提供了试剂、材料和分析工具。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

CRediT作者贡献声明

李泽华：写作 – 审稿与编辑，写作 – 初稿，方法学，研究，数据分析。冯一豪：写作 – 审稿与编辑，研究，数据分析。张宏瑞：写作 – 审稿与编辑，研究，数据分析。王新林：写作 – 审稿与编辑，研究，数据分析。李玉英：写作 – 审稿与编辑，数据分析。陈玉敏：写作 – 审稿与编辑，写作 – 初稿，研究，资金获取，

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：22376016和22022601）以及中国博士后科学基金（编号：GZB20250222的财政支持。