《Bioprinting》：Optimizing gelatin methacryloyl-based bioinks with nanohydroxyapatite for 3D bioprinting in bone tissue engineering
编辑推荐：
本研究探究了不同浓度纳米羟基磷灰石（nHA）对GelMA生物墨水可打印性、细胞活性和成骨分化能力的影响，发现1% nHA浓度最适宜。
Jannika T. Korkeam?ki|Rosanna Silen|Kristin Syverud|Kamal Mustafa|Ahmad Rashad|Susanna Miettinen
挪威卑尔根大学临床牙科系转化口腔研究中心（TOR）
摘要
近年来，将纳米羟基磷灰石（nHA）等陶瓷相纳入基于明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）的生物墨水中，引起了人们的关注，这种技术用于通过挤出打印来复制骨组织的无机矿物相。然而，不同浓度的nHA对生物墨水的可打印性、形状保真度、长期稳定性、细胞存活率和成骨活性等方面的影响尚未得到充分研究。因此，本研究探讨了将不同浓度的nHA（0%、1%、3%和5% w/v）纳入GelMA/明胶/纳米纤维素生物墨水中，用于打印人类骨髓来源的基质细胞以应用于骨组织工程。随着nHA浓度的增加，生物墨水的粘度也显著升高。含有最高浓度nHA的生物墨水无法保持打印物体的完整高度，而仅含1% nHA的生物墨则在可构建性和形状保真度方面表现更优。此外，nHA颗粒以浓度依赖的方式阻碍了光交联过程。较高的nHA浓度导致交联效果较差，从而影响了打印结构在培养条件下的稳定性。综合来看，粘度的增加和较高nHA浓度下的交联不足对细胞产生了不利影响：5% nHA的生物墨水导致细胞存活率降低和成骨分化受限。相比之下，1% nHA的生物墨水支持了较高的细胞存活率，保持了良好的代谢活性，并促进了成骨相关蛋白（Runx2、Col-I、DMP1、OCN）的产生。本研究强调了在多组分生物墨水中加入低浓度nHA相对于骨组织工程的重要性。
引言
基于挤出的生物打印技术作为一种革命性技术，能够在相对较短的时间内制造出大型且几何形状复杂的结构，以满足特定的设计要求。该技术利用生物墨水，这些墨水是经过设计的基于水凝胶的配方，旨在模拟细胞外基质（ECM），包裹活细胞，并在打印结构中支持或引导细胞的命运1, 2。对于骨组织工程而言，这类生物墨水有潜力从3D结构内部启动类似骨组织的成熟过程。
开发用于骨组织工程的有效生物墨水需要具备足够的粘度以支持大规模打印。同时，也越来越需要能够模拟天然骨组织物理化学和生物学特性的仿生生物墨水。骨组织ECM由有机相（主要由胶原蛋白构成）和无机相（主要由磷酸钙矿物构成）组成。明胶可以从胶原蛋白中提取并甲基丙烯酸化，生成明胶甲基丙烯酸酯（GelMA），这是一种常用于生物打印的光敏生物聚合物。尽管经过化学修饰，GelMA仍保持其生物相容性和可降解性，并通过从胶原蛋白继承的RGD序列促进细胞增殖和附着[3]。甲基丙烯酸化使GelMA能够进行光聚合，从而实现可控的交联和结构稳定性。然而，低浓度下的GelMA可打印性较差，可以通过在配方中加入牺牲性明胶来改善，以在挤出过程中提供热响应的形状保真度[4]。
为了模拟骨组织的无机相，生物墨水通常会加入磷酸钙陶瓷，如纳米羟基磷灰石（nHA）。由于羟基磷灰石的生物相容性和导电性，其在骨再生方面的潜力得到了广泛研究[5]。特别是纳米级的HA因其尺寸与天然骨矿物相相似而被优先选择，提供了更接近自然的无机成分。此外，将颗粒尺寸从微米级缩小到纳米级可以增加比表面积，从而提高在水凝胶基质中的分散性，并与聚合物相更有效地相互作用[6]。然而，将不透明的陶瓷相引入基于GelMA的生物墨水配方中可能会影响粘度、可打印性、光聚合以及嵌入细胞的生物反应。
生物墨水中陶瓷含量的增加会提高粘度，由于生物打印过程中产生的剪切应力，可能对细胞存活率产生不利影响[7]。这可以通过使用流变调节剂——纤维素纳米纤维（CNF）来补偿[8]。CNF的高长径比使其具有剪切稀释行为，从而降低挤出打印所需的压力。研究表明，CNF还能通过提高形状保真度来改善生物墨水的可打印性[9]。此外，CNF是高度生物相容的多糖，由β-1,4连接的葡萄糖单元组成，能够模拟ECM中的多糖成分，如透明质酸，非常适合支持组织再生所需的ECM结构[10]。
尽管已经有许多关于含有nHA的复合生物墨水的研究，但尚未确定促进成骨分化同时保持可打印性和细胞存活率的最佳nHA浓度。Coskun等人将低浓度的nHA（0.2–0.9%）引入2.2%壳聚糖基生物墨水中，但生物学研究仅限于评估打印后的细胞存活率[11]。Allen等人研究了微米级HA（0.5–2%）对10% GelMA/5%明胶生物墨水打印后结构的影响[12]，但未研究其对流变特性、可打印性或交联的影响。同时，Bastos等人使用6.67%藻酸盐/0.17%凝胶 gum（GG）生物墨水研究了HA（1%和5%）的作用[13]，但HA作为唯一的生物功能成分，没有设置对照组。
为了解决这一不足，本研究旨在探讨不同nHA浓度对生物墨水在多个功能阶段的影响，包括流变性、可打印性、交联以及全面的细胞维持能力，涵盖细胞存活率、代谢活性、增殖和细胞扩散。此外，还评估了嵌入的人类骨髓基质细胞（hBMSC）的成骨潜力。我们将低（1%）、中（3%）和高（5%）浓度的nHA加入5% GelMA/5%明胶/0.5% CNF中，并假设nHA的加入可以增强hBMSC的成骨分化。然而，我们也预计高浓度的nHA会增加粘度，降低可打印性，并在挤出打印过程中对细胞产生高剪切应力。此外，还研究了nHA对GelMA光聚合参数的影响。
部分内容摘要
生物材料墨水配方
所研究的生物材料墨水配方见表1。TEMPO氧化纤维素纳米纤维（CNF）凝胶原液（1%固含量，RISE PFI，挪威特隆赫姆）的制备方法如前所述[14]。制备生物材料墨水时，CNF通过高压灭菌进行消毒。然后将凝胶加热至60°C，并在搅拌过程中用超纯水补充灭菌过程中损失的水分。达到均匀溶液后，将溶液冷却至40°C
流变特性和可打印性
生物材料墨流的变理性测试结果见图1。关于剪切率依赖性，所有组的粘度随剪切率的增加而降低，显示出生物材料墨水的剪切稀释行为。此外，所有生物材料墨水的整体剪切粘度随nHA浓度的增加而增加。在温度依赖性方面，所有生物材料墨组的粘度在温度降低时均有所增加。
讨论
为了推进生物打印在骨组织工程中的应用，开发具有优异可打印性和导电性的仿生生物墨水至关重要。因此，在本研究中，我们探讨了不同浓度羟基磷灰石纳米颗粒对GelMA/明胶/纳米纤维素仿生生物墨流的流变特性、可打印性、长期稳定性和生物特性的影响。
将陶瓷相加入生物墨水中被证明可以
结论
我们证明了将nHA加入GelMA/明胶/CNF生物墨水中以模拟骨ECM的显著效果。nHA的添加影响了生物墨水的多个关键特性，包括流变性、形状保真度以及hBMSC的存活率和成骨分化。nHA浓度的增加导致粘度显著升高，这影响了挤出行为、结构高度的保持和光聚合效率。在5% nHA的情况下，生物墨水无法保持完整的
作者贡献声明
Kristin Syverud：资源管理、项目协调、资金获取。Rosanna Silen：撰写 – 审稿与编辑、验证、方法学设计、实验实施、数据分析。Ahmad Rashad：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目协调、资金获取、数据分析、概念构思。Kamal Mustafa：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目协调、资金获取、数据分析、概念构思。Susanna Miettinen：撰写 – 审稿与
数据可用性
本研究生成和分析的数据集可向相应作者索取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本项工作得到了卑尔根大学、Trond Mohn基金会（项目编号：BFS2018TMT10）、Olav Thon基金会以及挪威研究委员会通过NORCEL项目（项目编号：228147）、3DPRENT项目（项目编号：302043）和芬兰研究委员会Body-on-Chip研究中心（项目编号：336666和353177）的支持和资助。
作者感谢S?dra Cell（瑞典V?xjo）捐赠的软木浆。
