利用地衣状芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）产生的表面活性剂稳定的角蛋白酶对羽毛废弃物进行资源化处理，并将羽毛水解物作为氮源用于微生物培养基中

《Bioresource Technology》：Feather waste valorization using Bacillus licheniformis surfactant-stable keratinase and utilization of feather hydrolysate as nitrogen source in microbiological culture media

本研究分离出新型产角蛋白酶的Bacillus licheniformis NKPG菌株，通过鸡毛作为底物优化酶生产，发现其具有耐表面活性剂特性，并验证羽毛水解物可作为培养基有效氮源。

　　

普兰希·古普塔（Pranshi Gupta）| 纳文·坎戈（Naveen Kango）

微生物学系，哈里辛格·高尔大学（Dr. Harisingh Gour Vishwavidyalaya，一所中央大学），印度中央邦萨加尔（Sagar），470003

摘要

从新分离出的土壤细菌Bacillus licheniformis NKPG中生产出一种稳定的表面活性剂角质酶，通过以鸡羽毛为底物进行了参数优化，效果提高了3.6倍。该角质酶在60°C和pH 9.0条件下表现出最佳活性，并被鉴定为丝氨酸蛋白酶。在金属离子（Ca²⁺、Mg²⁺）、β-巯基乙醇和表面活性剂的存在下，其活性得到增强。X射线衍射（XRD）分析显示水解过程中结晶度降低，而光谱分析（FTIR、NMR和UV–Vis）证实了羽毛的溶解及氨基酸的释放。NKPG角质酶对多种表面活性剂和商用洗涤剂具有显著的稳定性，在与商用洗衣剂预孵育5小时后仍保留了超过70%的活性。分子对接研究表明，SDS、Tween-20和Tween-80直接与角质酶的活性位点结合，而Triton X-100和尿素则通过别构调节发挥调控作用。此外，鸡羽毛水解物（CFH）在微生物培养基中可作为有效的氮源，支持五种不同细菌和两种真菌的旺盛生长。这些发现清楚地体现了B. licheniformis NKPG的角质酶降解能力，以及其作为洗涤剂添加剂的潜力，并表明CFH可作为替代传统蛋白胨或牛肉提取物的蛋白质来源。

引言

近年来，家禽产业迅速发展，每年产生约1000万吨角质蛋白废弃物，其中包含约850万吨羽毛。随意丢弃或焚烧羽毛会加剧环境污染，增加病原体爆发的风险，从而引发禽霍乱和叶绿素缺乏症等疾病（Zhang等人，2023年）。羽毛含有超过85%的粗蛋白和70%的氨基酸，以及高价值的矿物质、维生素和生长激素，使其成为多种产业的潜在廉价蛋白质来源（Lai等人，2023年）。

富含蛋白质的水解物在工业上的一个重要用途是作为微生物培养基的氮源，通常使用蛋白胨、牛肉提取物等。然而，蛋白胨成本较高。为了降低培养基成本，人们正在使用动物组织、牛奶和植物等天然成分来提取蛋白胨（Akpor等人，2019年）。

目前，羽毛通过化学或热处理方法制成羽毛粉。但这些方法成本高昂、能耗大，并且会导致甲硫氨酸、赖氨酸、组氨酸和色氨酸等关键氨基酸的流失（Ramakrishna Reddy等人，2017年；Saeed等人，2024年）。与物理化学方法相比，微生物水解羽毛是生产羽毛粉、肥料、生物膜和生物能源的更优选择（Vidmar和Vodovnik，2018年；Das等人，2024年）。

顽固的角质蛋白具有密集的β-折叠多肽结构，通过二硫键形成广泛的交联，并通过非共价相互作用稳定（Aktayeva和Khassenov，2024年）。它可被微生物角质酶（EC3.4.21/24/99.11）降解，这类酶属于丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶（Moridshahi等人，2020年）。首次从Bacillus licheniformis菌株中纯化的角质酶（Ker A）属于枯草杆菌类丝氨酸蛋白酶家族（S8）（Lin等人，1995年）。该家族的其他细菌角质酶还包括来自B. subtilis、B. halodurans和Streptomyces的角质酶。此外，金属蛋白酶家族的角质酶也在多种细菌和真菌中被发现（Sharma等人，2022a）。

基于角质酶的降解方法是一种高效且经济可行的方法，可有效利用富含角蛋白的废弃物，同时关注废物管理、环境和人类安全问题，还能生成氨基酸、肽和非蛋白质含氮化合物（Sharma等人，2022a）。产生角质酶的微生物如细菌、放线菌和真菌在自然界中普遍存在，它们以角质蛋白为氮、碳、硫和能量的来源。这些微生物来源于羽毛、土壤和分解的有机物等环境（Rahimnahal等人，2023年）。其中，细菌（Bacillus属）生长较快，能产生大量胞外酶（Tork等人，2016年；Shen等人，2022年）。细菌降解角质蛋白的过程分为两个步骤：首先产生还原酶还原β-角质蛋白的二硫键，随后生成角质蛋白水解所需的蛋白酶，破坏残留的连接（Liaqat等人，2022年；Gupta等人，2025年）。

微生物角质酶的适应性是其广泛应用于环保技术进程中的关键因素。它们在多个行业中有广泛应用，如高效转化和合成羽毛粉、动物饲料、胶粘剂、生物肥料、化妆品（包括去屑洗发水），并且能够分解错误折叠的朊病毒蛋白（Admasie等人，2024年；Vidmar和Vodovnik，2018年）。一些角质酶对表面活性剂和其他洗衣剂具有较好的稳定性，优于洗涤剂行业常用的蛋白酶。因此，使用角质酶作为洗涤剂添加剂可显著提升洗涤效果，对织物几乎没有损害（Bokveld等人，2021年）。

鉴于上述背景，本研究旨在优化和表征新分离的B. licheniformis NKPG对羽毛的降解效果，采用经济高效且环保的方法。通过多尺度分析揭示了羽毛角质蛋白高效降解的机制，并通过分子对接分析了酶的表面活性剂稳定性。本研究还展示了鸡羽毛水解物作为微生物培养基替代氮源的可行性。

部分内容摘录

角质蛋白降解菌的分离

使用富集培养技术从印度中央邦萨加尔Patharia Hills地区的大学校园土壤样本中分离出角质蛋白降解菌，培养基中唯一营养来源为羽毛。使用的羽毛来自附近的家禽场，清洗后用作底物。

通过将土壤样本接种到含有完整羽毛的蒸馏水（1% w/v）预灭菌培养管中，对角质蛋白降解菌进行了筛选。

细菌的筛选与分离

从5个不同的土壤样本中共分离出6株细菌。根据固体培养基上产生的主要蛋白水解（酪蛋白酶和明胶酶）活性区（图S1 A），对3株细菌进行了角质酶活性和羽毛降解能力的评估。NKPG菌株在酪蛋白和明胶上的水解区最大，降解了最高比例的羽毛（56%）。该菌株在含有羽毛的培养基中产生的角质酶活性为8.45 U/ml，因此被选中。

结论

新分离的B. licheniformis NKPG菌株在48小时内能降解97%的羽毛角质蛋白。这种属于丝氨酸蛋白酶家族的胞外酶在pH 9.0和50°C条件下表现出最佳活性。多尺度表征显示其可顺序降解羽毛，生成富含氨基酸的角质蛋白水解物，证明了其在有效管理羽毛废弃物方面的潜力。

缩写

FMMSA
羽毛粉最小盐琼脂
OVAT
一次一个变量
CCD
中央复合设计
RSM
响应面方法
SD
标准差
BSA
牛血清白蛋白
TCA
三氯乙酸
TMS
四甲基硅烷
EDTA
乙二胺四乙酸
PMSF
苯甲基磺酰氟
β-ME
β-巯基乙醇
SDS
十二烷基硫酸钠 TLC
薄层色谱 SEM
扫描电子显微镜 NMR
核磁共振 FTIR
傅里叶变换红外光谱 XRD
X射线粉末衍射 RMSD
均方根

CRediT作者贡献声明

普兰希·古普塔（Pranshi Gupta）：撰写初稿、可视化处理、验证、软件应用、方法设计、实验研究、数据分析、概念构建。

纳文·坎戈（Naveen Kango）：撰写修订稿、可视化处理、验证、监督、软件应用、资源协调、项目管理、资金申请、数据分析、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

作者（NK和PG）感谢印度医学研究委员会（ICMR）通过研究项目2021-14350提供的资金支持，同时感谢哈里辛格·高尔大学先进研究中心（CAR）和DST PURSE（II）项目提供的仪器设备支持。