基于PAM组装的CRISPR-Cas12a激活机制的荧光与比色双模生物传感器，用于检测前列腺癌外泌体

《Biosensors and Bioelectronics》：PAM-assembled CRISPR-Cas12a activation-based fluorescent and colorimetric dual-modal biosensor for detecting prostate cancer exosomes

前列腺特异性膜抗原（PSMA）阳性外泌体的高灵敏检测面临低丰度与类似颗粒干扰问题。本研究开发了一种基于PAM组装的CRISPR-Cas12a激活型双模态生物传感器，结合CeO? NZ实现荧光与比色检测，极限检测浓度分别为49和63 particles/μL，显著提升特异性与灵敏度。

苗圆圆|王创|彭越|孙新媛|郑兆坤|张倩蕾|程文婷|李金龙

南京中医药大学第二附属医院临床实验室，中国南京，210003

摘要

前列腺特异性膜抗原（PSMA）阳性的外泌体在前列腺癌的诊断和风险评估中具有巨大潜力。然而，由于它们在血液中的含量较低以及来自大小相似颗粒的干扰，准确检测受到严重阻碍。在这项研究中，我们开发了一种基于原间隔序列（PAM）组装的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas12a激活的荧光和比色双模生物传感器，用于高灵敏度检测PSMA阳性外泌体。该传感器利用两条分别含有CD63和PSMA适配体的分离链与外泌体表面的目标分子结合，形成诱导发夹DNA（HP DNA）打开的模板。通过发夹结构向双链结构的转变产生PAM位点。CRISPR-Cas12a识别PAM并激活以切割标记有FAM的探针，从而产生荧光信号；而二氧化铈纳米酶（CeO₂ NZ）（具有磷酸酶模拟活性）则水解切割产物。水解产生的羟基自由基将3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）氧化，从而产生比色反应。CRISPR-Cas12a-纳米酶的双重识别显著提高了前列腺癌外泌体的检测选择性和灵敏度。在优化条件下，荧光和比色模式的检测限分别达到49个颗粒/μL和63个颗粒/μL。通过相互验证这两种检测模式，该生物传感技术能够准确区分前列腺癌患者和健康个体，为早期诊断带来了巨大希望。

引言

前列腺癌是全球男性中发病率和死亡率较高的恶性肿瘤，其发病率持续上升，对男性的健康和生活质量产生显著影响（Boixareu等人，2025；Rizzo等人，2022；Teo等人，2019）。尽管前列腺特异性抗原（PSA）已被广泛用于早期临床筛查，但其有限的特异性常常导致假阳性和过度治疗（Cai等人，2018；Zhang等人，2018）。外泌体是细胞主动分泌的小囊泡，具有磷脂双层结构，携带多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质（Doyle和Wang，2019；Lai等人，2022；Zhang等人，2020）。越来越多的证据表明，肿瘤来源的外泌体在肿瘤微环境调节、远处转移和耐药性形成中起着关键作用（Kumar和Deep，2020；Wang等人，2022）。前列腺特异性膜抗原（PSMA）阳性外泌体在前列腺癌细胞中高度富集，但在正常组织中很少见。这一特性为前列腺癌的精准诊断、分期和靶向治疗提供了新的方向（Cheng等人，2023；Li等人，2021）。检测这些外泌体有望提高早期筛查的灵敏度，促进个性化治疗，并实现动态监测，推动前列腺癌的精准医疗发展（Permpoka等人，2025；Severic等人，2021）。

目前，检测外泌体的传统方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）（Xia等人，2020）、纳米粒子跟踪分析（NTA）（Fan等人，2022）和流式细胞术（Hu等人，2023）。尽管这些方法可靠，但操作复杂、耗时且依赖于实验室环境，难以满足实时和便捷的临床检测需求。近年来，出现了多种创新检测技术，以促进外泌体的临床应用。例如，Zheng等人开发了一种使用氧化石墨烯（GO）的简单荧光适配体传感器来检测PSMA阳性外泌体（Li等人，2020）。Yu等人设计了一种基于CD63和上皮细胞粘附分子（EpCAM）抗体的微流控拉曼生物传感器用于检测前列腺癌外泌体（Li等人，2019）。Grel等人通过荧光光谱和标准添加方法监测药物装载情况，证实SW480来源的外泌体可以通过电穿孔有效装载多柔比星，为肿瘤来源外泌体研究中的光谱方法应用提供了范例（Grel等人，2026）。虽然这些方法不需要昂贵的仪器且操作简便，但其灵敏度和特异性仍不足以在临床环境中广泛应用。

规律间隔短回文重复序列（CRISPR）阵列和CRISPR相关（Cas）蛋白组成一个集成CRISPR-Cas系统（Gong等人，2022；Li等人，2022；Liu等人，2021；Zeng等人，2022a），该系统广泛应用于分子诊断。当CRISPR识别目标DNA中的特定序列时，Cas12a蛋白被触发对双链DNA（dsDNA）进行顺式切割和对单链DNA（ssDNA）进行反式切割（Kim等人，2024；Wang等人，2023）。在这个系统中，原间隔序列（PAM）在目标识别中起着关键作用（Deng等人，2024；Tao等人，2025）。典型的PAM是一个包含5′–TTTN–3′的短核苷酸序列。通过识别这个PAM序列实现对目标DNA的特异性识别，从而确保精确的目标检测（Yao等人，2026；Yu等人，2025）。目标识别后，报告分子被高效切割，产生荧光信号，提高了检测平台的灵敏度（Gong等人，2021；Zeng等人，2021，2022b）。值得注意的是，Cas12a的切割产物在二氧化铈纳米酶（CeO₂ NZ）的水解作用下产生羟基自由基（•OH）。随后，这些自由基氧化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB），产生比色反应（Chen等人，2025）。

受上述研究的启发，我们开发了一种基于PAM位点的双模生物传感器，用于高灵敏度检测与前列腺癌相关的外泌体，将CeO₂ NZ整合到CRISPR-Cas12a系统中。适配体对PSMA阳性外泌体的特异性识别促进了结合的分离链的共定位，从而激活链位移反应并完成PAM组装。这一过程调节了Cas12a的反式切割活性，产生荧光响应。此外，CeO₂ NZ和H₂O₂被引入CRISPR-Cas12a反应系统。Cas12a产生的核苷酸产物在CeO₂ NZ的磷酸酶模拟作用下被水解，产生大量•OH自由基。这些自由基最终氧化TMB，导致颜色变化，作为比色检测的响应。与现有的外泌体检测方法相比，这种生物传感器具有多重优势：（i）使用基于邻近性的PAM组装策略确保了对目标外泌体的特异性识别，从而精确调控Cas12a的反式切割效率；激活的Cas12a切割大量荧光报告底物，产生强烈的荧光响应；（ii）将CeO₂ NZ作为信号元素整合到CRISPR/Cas系统中，显著提高了生物传感器的灵敏度，并在即时检测场景中实现快速直观的读数，同时有效降低了假阳性结果的风险；（iii）CeO₂ NZ的酶模拟特性使其能与CRISPR/Cas系统结合，提供可见的比色读数和荧光读数，从而实现双模响应。为了解决现有前列腺癌外泌体检测方法操作复杂、灵敏度不足和特异性差的问题，我们将CRISPR-Cas12a的特异性识别特性与CeO₂ NZ的酶模拟特性相结合，构建了一个双模检测平台，有望为前列腺癌的早期筛查提供一种新颖、准确、高效且低成本的检测策略。

材料与试剂

寡核苷酸由Sangon Biotech有限公司（中国上海）合成，并通过高效液相色谱（HPLC）纯化。所有核苷酸序列列于表S1中。EnGen Lba Cas12a及其对应的NEBuffer r2.1购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州）。3,3,5,5-四甲基联苯胺二盐酸盐（TMB HCl）购自Aladdin。二氧化铈纳米颗粒（平均尺寸<25 nm）（CeO₂ NZ）购自Sigma-Aldrich（圣路易斯）。

双模检测原理

前列腺癌外泌体检测的双模适配体传感器原理如图1所示。两条分别含有CD63和PSMA适配体的分离链在前列腺癌外泌体存在的情况下与外泌体表面的CD63和PSMA结合，促进分离链的共定位。当引入发夹结构时生成PAM序列，随后通过链位移转化为双链DNA构型。

结论

总之，我们构建了一种基于PAM的双模方法，通过整合Cas12a的特异性目标识别和反式切割活性以及CeO₂ NZ的磷酸酶模拟活性，实现了前列腺癌外泌体的精确检测。该生物传感器不仅简单且灵敏度高，还具有特异性和稳定的回收率。更重要的是，该生物传感器在检测前列腺癌外泌体方面表现出优异的特异性。

作者贡献声明

苗圆圆：数据整理、研究、方法学设计、初稿撰写。王创：研究。彭越：研究。孙新媛：研究。郑兆坤：研究。张倩蕾：研究。程文婷：资金获取、研究。李金龙：概念提出、资金获取、资源协调、监督、可视化、撰写——审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（资助编号：82572672）、江苏省自然科学基金（资助编号：BK20240264）、南京第二医院人才提升项目（资助编号：RCZD23001）以及江苏省中医药科技发展计划（资助编号：MS2023063）的支持。