《Diagnostic Microbiology and Infectious Disease》：A ROADMAP FOR RAPID DETECTION OF TUBERCULOSIS THROUGH MICROFLUIDIC LAB-ON-CHIP STRATEGIES
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Mcr7 sRNA调控结核分枝杆菌毒力及应激适应，其通过抑制Tat分泌途径影响细菌活性，但目前尚未作为有效诊断标志物验证。结合微流控芯片技术，提出通过反义探针检测Mcr7实现活菌特异性诊断，但需解决sRNA短小易降解等技术难题并开展临床验证。
Iswarya Rambabu|Thirunavukkarasu Palaniyandi|Hemapreethi Surendran|Sandhya Nedunchezhian|Abdullah A. Aseeri|Mohd Saeed|Tarun Kumar Upadhyay|Manivannan|Asha Sivaji|Abimanyu Sukumar|Natarajan Palaniappan
印度金奈M.G.R教育与研究所生物技术系，邮编600095
摘要
结核分枝杆菌中的小调节RNA已成为影响毒力和应激适应的重要因子，人们对它们作为潜在诊断生物标志物的兴趣日益增加。其中，Mcr7是一种受PhoP调控的sRNA，它通过抑制tatC的翻译来影响双精氨酸转运（Tat）分泌途径，是一种被广泛研究的调节分子。尽管其在中毒力控制中的分子作用已通过实验得到证实，但其诊断应用尚未得到充分探索。本文综述了目前关于结核分枝杆菌中sRNA介导的调节机制的知识，特别关注Mcr7，并探讨了将sRNA检测集成到微流控芯片（Lab On Chip, LOC）平台中的可行性。我们讨论了现有的基于RNA的结核病诊断策略，但这些策略在处理小型非编码RNA时存在技术挑战，同时也分析了基于反义探针的芯片上分离和诊断的实际问题。本文并未将Mcr7视为一个经过验证的生物标志物，而是强调其作为需要严格临床评估的候选目标的潜力。这种跨学科的研究旨在将sRNA的概念与新兴的微流控技术结合起来，用于结核病诊断，并概述了开发下一代结核病生物传感工具所需的限制和验证步骤。
引言
结核分枝杆菌是导致结核病的主要病原体。不到10%的感染者会发展成活动性结核病，每年导致约900万新病例和160万人死亡（世界卫生组织2023年全球结核病报告）。"剩余的90%感染者不会出现任何症状；然而，细菌可能以无症状潜伏感染的形式存在，并随时有可能重新激活。与其他许多细菌病原体不同，结核分枝杆菌在宿主体内的生长非常缓慢（通常需要6-8周），这给早期诊断带来了困难"（Alsayed等人，2023年）。此外，如果在疾病早期使用抗生素治疗，结核病的治疗效果较好。虽然基于核酸的诊断方法显著提高了结核杆菌的检测率，但现有平台仅针对DNA进行检测，而无法区分存活和死亡的细菌。在这种情况下，包括Mcr7在内的调节RNA的潜在作用反映了细菌的活跃转录状态，但这一作用尚未得到充分验证（Alcaide等人，2011年）。
结核病的诊断方法仍然效率低下，且在识别活细胞方面缺乏准确性。主要的问题在于缺乏专门针对Mcr7 sRNA设计的微流控平台，这主要是由于Mcr7的产量有限且长度较短（<100个核苷酸）。本文提出了一种设计针对Mcr7的sRNA诊断探针的计划，尤其是将其集成到优化的微流控芯片（Lab-on-Chip, LOC）环境中。"目前，结核病的诊断方法包括影像学检查（胸部X光、CT）、显微镜下痰液涂片检查、支气管镜检查以及分子核酸检测（如GenExpert MTB）。
本文指出了当前Mcr7特异性诊断技术中的挑战，强调了技术上的空白，并提出了利用微流控技术开发下一代结核病生物传感工具的概念框架。结核病的发病机制可以解释细菌如何借助Mcr7侵入免疫系统，这为开发新的诊断技术提供了可能。随着对结核病发病机制的深入了解，未来可能会利用像Mcr7这样的sRNA来检测潜伏感染。
结核分枝杆菌中的sRNA
小调节RNA（sRNA）在结核分枝杆菌的转录后调控中起着重要作用。转录组研究表明，在应激条件下会表达多种非编码RNA，这表明它们在支持细菌生长方面也发挥着作用[5]。在已鉴定的sRNA中，Mcr7在致病机制方面表现得最为明显。它受到PhoP抑制系统的调控，该系统直接合成Mcr7 sRNA。
基于微流控的结核病分子诊断：当前进展及小RNA作为诊断生物标志物的潜力
为了诊断结核病，人们越来越多地研究微流控芯片技术，尤其是在基于核酸的检测系统中（[45]；Lehnert等人，2024年）。这些平台通过为样品处理、核酸提取、扩增和检测设置独立的通道，实现了自动化操作并减少了试剂消耗[54]。微流控设备提供了快速的反应时间和可控的环境。
Mcr7：结核分枝杆菌中的一种受PhoP调控的sRNA
PhoP调控的最显著位点位于rv2395和PE_PGRS41之间的基因间区域，mcr7基因编码一种小型非编码RNA（ncRNA）。"Northern blot实验确认了PhoP突变体中不存在Mcr7，同时发现Mcr7在结核分枝杆菌中的表达水平较低[51]。"利用RNA折叠服务器预测，Mcr7具有一个33个核苷酸长的自由环结构。
用于Mcr7检测的反义探针的微流控集成
本研究提出的诊断策略专门针对Mcr7小RNA的检测，而非tatC mRNA。尽管已经机械表征了Mcr7与tatC 5′区域之间的相互作用[51]，但这种调控关系主要用于识别Mcr7结构中的可结合区域。这里描述的反义探针设计为与Mcr7的单链区域完全互补。
结论与未来展望
目前的结核病诊断主要依赖于DNA检测，而Mcr7是一种调节性sRNA，由于其在校准活跃细菌发育中的作用，需要进一步验证。实验验证是必要的，以确定Mcr7的表达是否与临床样本中细菌的存活状态相关。重要的是，还需要评估Mcr7的临床应用价值。
未引用的参考文献
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CRediT作者贡献声明
Iswarya Rambabu：撰写初稿，概念构思。Thirunavukkarasu Palaniyandi：撰写初稿，概念构思。Hemapreethi Surendran：验证。Sandhya Nedunchezhian：验证。Abdullah A. Aseeri：监督，资源提供。Mohd Saeed：撰写初稿，概念构思。Tarun Kumar Upadhyay：撰写初稿，概念构思。Manivannan：撰写初稿，概念构思。Asha Sivaji：撰写与编辑，验证。
