《Displays》：Single-Cell Transcriptomics Reveal PRRC1 as a Malignant Cell Enriched Driver of DNA Repair and Therapy Resistance in Glioblastoma
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PRRC1通过调控DNA损伤修复和应激适应程序促进胶质母细胞瘤增殖并增强治疗抵抗，单细胞测序和功能验证证实其抑制可改善预后。
Sachin Kumar | Ming-Cheng Tsai | Dahlak Daniel Solomon | Juan Lorell Ngadio | Do Thi Minh Xuan | Ching-Chung Ko | Hung-Yun Lin | Meng-Chi Yen | I-Jeng Yeh | Yung-Kuo Lee | Hui-Ru Lin | Jian-Ying Chuang | Chih-Yang Wang | Ngoc Uyen Nhi Nguyen
台湾台北医学大学医学院癌症分子生物学与药物发现项目，台北11031
摘要
胶质母细胞瘤（GBM）是最具侵袭性的原发性脑肿瘤，对放疗和基于替莫唑胺的治疗仍然具有高度抗性。尽管这些治疗方法能够诱导DNA损伤，但GBM细胞常常通过激活DNA损伤反应（DDR）信号通路、检查点通路和应激适应程序来存活。虽然核心DNA修复酶已被充分研究，但调节恶性GBM细胞中DDR相关细胞状态的调控因子仍不完全清楚。我们进行了无偏的多组学分析，整合了单细胞RNA测序、批量转录组学数据和TCGA DNA甲基化数据，发现富含脯氨酸的卷曲螺旋1（PRRC1）是一个关键候选基因。PRRC1在癌症中的研究较少，其在GBM中的作用尚未明确。通过基因本体论（Gene Ontology）、MetaCore通路富集和基因集富集分析发现，PRRC1与染色质组织、细胞周期调控以及DDR相关程序（包括同源重组和检查点信号通路）有显著关联。利用GDSC数据集评估了药物基因组学相关性，并使用AlphaFold预测的PRRC1结构进行了分子对接实验。与正常脑组织相比，PRRC1在GBM中的表达显著升高，且其表达水平随胶质瘤级别的增加而增加，这与患者生存率的降低相关。单细胞分析显示，PRRC1在恶性肿瘤细胞中富集程度较高，在非恶性细胞中表达较低。使用shRNA介导的敲低技术在U87细胞和患者来源的GBM细胞中进行功能验证，结果显示PRRC1敲低后细胞的增殖能力、克隆存活能力、无锚定生长能力和三维球体形成能力均显著下降。在基因毒性应激下，PRRC1缺陷细胞表现出增强的γ-H2AX积累，表明DNA损伤信号负担增加，应激耐受性降低。总体而言，这些发现表明PRRC1支持GBM的增殖和应激适应转录状态，其抑制可削弱肿瘤细胞的适应性，提示PRRC1可能是胶质母细胞瘤的潜在治疗靶点。
引言
胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统中最具侵袭性的原发性恶性肿瘤，尽管接受了多种联合治疗，但其死亡率仍然很高。标准治疗方案包括最大范围的手术切除，随后进行放疗并同时使用替莫唑胺（TMZ）辅助治疗，但中位生存期很少超过两年。治疗失败的原因在于多种生物学屏障的叠加，包括肿瘤内的高度异质性、免疫逃逸、药物难以穿透血脑屏障以及普遍存在的基因组不稳定性。这些因素使肿瘤细胞能够适应细胞毒性应激并在治疗后重新增殖，因此需要识别维持GBM存活和耐药性的分子机制。
放疗和替莫唑胺主要通过诱导DNA损伤来发挥抗肿瘤作用[1][2][3]。电离辐射会产生一系列损伤，包括碱基损伤、单链断裂和双链断裂（DSBs），这些损伤既通过直接能量沉积产生，也通过活性氧物种的产生而形成。DSBs是一种高度细胞毒性的损伤，会激活DNA损伤反应（DDR），该信号网络由ATM和ATR激酶协调，负责维持细胞周期检查点并调控DNA修复[4][5][6][7]。DSB的修复主要通过非同源末端连接（NHEJ）途径（快速但易出错）和同源重组（HR）途径（高保真度，仅限于S/G2阶段）完成[9][10][11]。这些途径的有效参与使GBM细胞能够耐受辐射引起的损伤，并有助于其产生放疗抗性。另一方面，替莫唑胺通过甲基化DNA碱基来诱导另一种形式的基因毒性应激[12][13][14]。虽然大多数替莫唑胺引起的损伤通过碱基切除修复得到修复，但其细胞毒性主要由O6-甲基鸟嘌呤加合物引起。在DNA复制过程中，这些加合物与胸腺嘧啶错配，触发错配修复（MMR）依赖的无效修复循环，最终导致复制相关DSBs的形成。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（MGMT）可以直接逆转O6-甲基鸟嘌呤，这解释了为什么MGMT启动子甲基化是预测替莫唑胺疗效的重要指标[15][16][18]。然而，仅靠MGMT状态无法完全解释治疗结果，MMR、检查点控制和应激反应程序的改变可以使GBM细胞在不死亡的情况下耐受替莫唑胺引起的DNA损伤。因此，GBM对基因毒性治疗的抗性不仅反映了核心DNA修复酶的活性，还涉及DDR信号通路、检查点动态和细胞应激适应性的高级调控。这些机制在具有干细胞特征的恶性细胞亚群中尤为明显，这些细胞具有更强的基因组维持能力、抗氧化能力和复制可塑性[19][20]。因此，识别以细胞状态特异性调节DDR输出的调控因子对于理解治疗抵抗性和发现新的治疗靶点至关重要。
富含脯氨酸的卷曲螺旋1（PRRC1）是一种在癌症生物学中研究较少的蛋白质，其功能注释有限。现有的机制研究主要将其与分泌途径的调控联系起来，包括其在内质网（ER）出口位点的定位及其在COPII包被组装和ER到高尔基体运输中的作用。与此一致，基因注释将PRRC1与细胞组织和亚细胞定位相关联，尤其是在细胞质和高尔基体相关区域[21][22]。然而，这些数据并未明确PRRC1在经典DNA损伤反应（DDR）通路中的直接作用。除了机制研究外，PRRC1还出现在其他癌症类型的转录组预后模型中，例如头颈癌中的替代剪接相关预测因子，表明其具有潜在的临床意义，但其生物学功能仍需进一步研究。
在这项研究中，我们结合了单细胞转录组学、批量多组学分析和功能验证来探讨PRRC1在GBM中的作用。我们发现PRRC1在恶性肿瘤细胞中富集程度较高，并与增殖、DNA修复和应激适应程序相关。PRRC1的功能扰动使GBM细胞对基因毒性应激敏感，并影响其生长，这支持了PRRC1在维持DNA损伤耐受性和治疗抵抗性中的作用。我们的研究结果将PRRC1确定为一种在恶性细胞中富集的DDR调节因子，并认为它是胶质母细胞瘤的潜在治疗靶点。本研究的工作流程如图1所示。
基因表达模式与预后关联
本研究使用了公开可用的数据集来分析GBM中的PRRC1表达。基因表达矩阵、临床注释和生存数据来自主要的癌症基因组资源，包括癌症基因组图谱（TCGA）、中国胶质瘤基因组图谱（CGGA）和基因表达组学数据库（GEO），这些资源提供了带有临床元数据的基于队列的转录组学谱型。我们使用了广泛的数据分析工具进行了跨队列表达比较和数据可视化。
PRRC家族成员的功能注释
PRRC家族成员的基因注释和染色体位点见表1。PRRC家族包含四个编码蛋白质的基因（PRRC1、PRRC2A、PRRC2B和PRRC2C），它们在结构上相似，但在功能注释上有所不同。虽然PRRC2A-C与RNA处理、应激颗粒组装和发育程序有关，但PRRC1的功能尚未得到充分研究，在癌症或DNA损伤反应通路中的作用尚不明确。
讨论
GBM之所以仍然是一种致命的恶性肿瘤，很大程度上是因为肿瘤细胞能够耐受持续的DNA损伤，并在慢性复制和氧化应激下持续增殖。尽管有BRCA1/2、ATM/ATR和PARP1等经典的DNA损伤反应（DDR）调节因子对基因组维持和治疗反应至关重要，但这些通路并不能完全解释GBM细胞如何在持续的复制应激和代谢损伤下保持生长。这一差距表明，还需要进一步研究其他相关机制。
资助
本研究得到了台湾国家科学技术委员会（NSTC）的资助（NSTC 112-2637-B-038-006, 113-2320-B-393-001, 114-2320-B-393-003, 114-2320-B-393-004, 114-2314-B-038-133-MY3, 114-2811-B-038-046），以及新光吴胡秀纪念医院（SKH-TMU-113-06和SKH-TMU-114-03）和高雄军队总医院（KAFGH_D_114024, KAFGH_D_114053, KAFGH_D_115073, KAFGH_D_115057）的支持，同时还得到了“台北医学大学癌症转化研究中心”的支持。
伦理批准和参与同意
不适用。
出版同意声明
所有作者均已阅读并批准了手稿的最终版本，并同意其发表。作者声明没有利益冲突。
作者贡献声明
Sachin Kumar：撰写初稿和修订手稿、方法学设计、实验设计、数据管理。
Ming-Cheng Tsai：撰写初稿、方法学设计、实验设计、数据管理。
Dahlak Daniel Solomon：软件开发。
Juan Lorell Ngadio：数据可视化、软件开发。
Do Thi Minh Xuan：手稿修订。
Ching-Chung Ko：数据可视化、软件开发、资源提供。
Hung-Yun Lin：资源提供。
Meng-Chi Yen：数据可视化。
I-Jeng Yeh：数据可视化、资源提供。
Yung-Kuo Lee：数据可视化。
Hui-Ru Lin：数据可视化。
