《Drug Metabolism and Disposition》：Neddylation Inhibition Sensitizes Gastric Cancer to 5-FU by Targeting the Post-Translational Stability of the Metabolic Enzyme DPD
张倩倩|胡静怡|刘阳波|谢东昭|白琳月|胡壮|唐彦军|冯思琪
教育部药学科学院与先进制药技术重点实验室，郑州大学，中国郑州450001
摘要：
5-氟尿嘧啶（5-FU）作为胃癌化疗的基石，其治疗效果主要受到肿瘤内代谢失活的限制。二氢嘧啶脱氢酶（DPD）是导致5-FU失活的限速酶，而该酶在肿瘤中的过度表达是5-FU耐药性的主要机制。本文报道了一种通过靶向DPD的翻译后调控来提高5-FU敏感性的新策略。我们发现，激活NEDD8的酶（NAE）抑制剂MLN4924在胃癌的细胞和动物模型中显著增强了5-FU的抗肿瘤活性，且不会增加全身毒性。机制上，MLN4924通过抑制依赖于NAE1/UBC12轴的DPD neddylation过程，从而触发DPD的泛素化及随后的蛋白酶体降解，减少细胞内5-FU的代谢，增强其细胞毒性效应。我们的研究揭示了neddylation是调控DPD蛋白稳定性和活性的一个先前未被认识到的机制。这项工作将neddylation-DPD轴确定为一个新的治疗靶点，并为将NAE抑制剂与基于5-FU的胃癌化疗结合提供了有力的理论依据。
章节摘录
1. 引言
胃癌仍然是全球主要的健康负担，系统化疗是晚期胃癌的主要治疗手段。1 5-氟尿嘧啶（5-FU）及其口服前体药物构成了许多联合治疗方案的基础，然而临床疗效常常因药物耐药性的产生而受到限制。2,3,4 二氢嘧啶脱氢酶（DPD）由DPYD基因编码，是负责5-FU代谢失活的限速酶。
2.1. 化学品和试剂
5-氟尿嘧啶（5-FU）纯度大于99%，MG132纯度大于98%，环己亚胺（CHX）纯度大于94%，均购自MedChemExpress（上海，中国）。MLN4924纯度大于98%，购自TagerMol（上海，中国）。DPD抗体（ab134922，1:1000）、NAE1抗体（ab187142，1:1000）和Ki67抗体（ab15580，1:1000）购自Abcam。NEDD8抗体（#2745，1:1000）、切割型caspase 9抗体（#52873，1:1000）和切割型PARP抗体（#5625，1:1000）购自Cell Signaling。3.1. MLN4924增强5-FU在胃癌细胞中的细胞毒性效应
我们首先进行了SRB实验，评估了5-FU对不同胃癌细胞系（包括MGC-803、HGC-27、BGC-823、AGS和MKN-45）的细胞毒性作用。剂量-反应分析显示5-FU具有浓度依赖性的抗增殖效应，随着浓度的增加，细胞存活率逐渐下降（图1A-1B）。根据计算得出的半数抑制浓度（IC50）值，选择HGC-27和MGC-803细胞系进行后续实验。
4. 讨论
NEDD8的neddylation修饰途径在人类癌症中经常过度激活，与不良临床结果相关，使其成为抗癌治疗的一个有前景的靶点。30,31 MLN4924是一种选择性的NEDD8激活酶E1抑制剂，能够抑制cullin和非cullin底物的异常neddylation，导致Cullin-ring ligase（CRL）底物的积累、特定致癌蛋白的降解，最终阻断肿瘤细胞的增殖。32
作者贡献声明
张倩倩：撰写初稿、资源准备、方法学设计、数据整理、概念构建。胡静怡：审稿与编辑、撰写初稿、资源准备、方法学设计、数据分析。刘阳波：资源准备、数据分析。谢东昭：资源准备、方法学设计。白琳月：审稿与编辑、结果验证、实验监督。胡壮：审稿与编辑、结果验证、数据分析。唐彦军：资源准备、数据分析。
作者贡献声明
张倩倩：概念构建、数据整理、实验设计、方法学设计、资源准备、撰写初稿。胡静怡：数据分析、方法学设计、撰写初稿、审稿与编辑。刘阳波：数据整理、数据分析、资源准备。谢东昭：方法学设计、资源准备。白琳月：实验监督、结果验证、审稿与编辑。胡壮：数据分析、结果验证、审稿与编辑。唐彦军：数据整理、数据分析、资源准备。致谢
我们衷心感谢所有参与者的宝贵贡献和辛勤工作。
资金支持
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82104279）和河南省重点科技项目（项目编号：252102311235）的支持。
