《Enzyme and Microbial Technology》：Development of a plasmid-free
Escherichia coli strain for high-yield production of ergothioneine
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基于多拷贝染色体整合CRISPR关联转座酶系统（MUCICAT），在无质粒大肠杆菌中成功构建ERG（硫代半胱氨酸）生物合成平台，最高获得370.0 mg/L ERG产量，并实现5升生物反应器中10.1 g/L的规模化生产，验证了基因拷贝数与代谢平衡对产量的影响。
张路文|唐家伟|冯美清|陈少新
复旦大学上海免疫治疗工程研究中心药学科学院，中国上海201203
摘要
谷胱甘肽（ERG）是一种含硫氨基酸衍生物，以其抗氧化活性而闻名，在医疗保健和营养领域有广泛的应用。由于生长迅速和遗传工具完善，大肠杆菌被广泛用作ERG生产的平台。然而，大多数工程菌株依赖于基于质粒的表达系统，这些系统在遗传上不稳定。此外，需要抗生素来维持质粒稳定性，进一步限制了基于质粒的系统在工业规模生产中的可行性。在这里，我们利用多拷贝染色体整合CRISPR相关转座酶（MUCICAT）系统建立了一个无质粒的大肠杆菌平台用于ERG生物合成。我们首先将一个三基因ERG生物合成途径以不同的拷贝数整合到大肠杆菌基因组中，得到了一个五拷贝菌株（P5），其ERG浓度最高达到222.5 ± 5.0 mg/L。随后，我们通过反复整合相关基因加强了两个关键催化模块——组氨酸甲基化和SAM生物合成，得到了一个无质粒的菌株P18，其ERG产量为370.0 ± 7.0 mg/L。工程菌株P18表现出优异的遗传稳定性，这一点通过连续传代得到了证实。在5升生物反应器中以补料分批模式扩大生产规模后，ERG浓度达到了10.1 g/L。这项研究展示了一种基于稳定多拷贝染色体整合的ERG生产策略，突显了其作为高效ERG生产平台的潜力。
引言
谷胱甘肽（ERG）是一种含硫的组氨酸衍生物，由于其强大的抗氧化特性而受到广泛关注[1]、[2]。它具有多种生物学功能，包括紫外线防护[3]、抗炎作用[4]和自由基清除[5]，因此在化妆品、膳食补充剂[6]、[7]、[8]、[9]中有广泛应用。尽管ERG在多种生物体中广泛存在，但其生物合成仅限于微生物，人类只能通过饮食摄入获得[9]、[10]、[11]。
目前，已经阐明了多种ERG生物合成途径，大致可分为需氧和厌氧途径（图S1）。需氧途径进一步分为细菌系统，以egtABCDE基因簇为代表，以及真菌系统，以egt1和egt2同源物为代表[11]、[12]。在厌氧生物合成途径中，硫通过一种不依赖氧气的反应直接连接到三甲组氨酸（TMH）上，该反应涉及来自绿硫细菌的EanB酶和来自Caldithrix abyssi的金属蝶呤依赖性谷胱甘肽合成酶（MES）[13]、[14]。
基于对ERG生物合成途径的阐明和多种生物合成策略的开发，人们投入了大量努力来开发用于大规模ERG生产的微生物细胞工厂。已经开发了多种微生物平台来生产ERG，包括细菌宿主如大肠杆菌、Mycolicibacterium neoaurum和Corynebacterium glutamicum [15]、[16]、[17]、[18]，以及真菌系统如Aspergillus oryzae、Saccharomyces cerevisiae和Yarrowia lipolytica [19]、[20]、[21]、[22]。S. cerevisiae和Y. lipolytica是常用的ERG生产真菌表达系统（表S1）。Van der Hoek等人首次在S. cerevisiae中实现了ERG的生产，通过筛选ERG生物合成途径的组合并增加了来自Neurospora crassa的Egt1和来自Claviceps purpurea的Egt2的基因拷贝数[23]。Liu等人利用多拷贝整合工具构建了一个产ERG的Y. lipolytica菌株，在168小时培养后获得了7.3 g/L的ERG浓度[20]。最近，Hu等人在Y. lipolytica中实现了最高的ERG产量，通过工程改造来自Trichoderma reesei的TrEgt1蛋白并增加了硫和前体氨基酸的供应，达到了9.3 g/L[24]。尽管酵母系统在ERG生物合成方面具有巨大潜力，但仍存在一些关键挑战，包括漫长的发酵过程和遗传操作的复杂性。相比之下，大肠杆菌作为底盘微生物具有多个优势，包括快速生长率、简单的培养要求以及多样的遗传工程工具。Chen等人在大肠杆菌中表达了来自T. reesei的异源ERG生物合成基因，获得了4.3 g/L的ERG浓度[25]。同年，Zhang等人通过工程改造关键的ERG生物合成酶，在大肠杆菌中实现了5.4 g/L的ERG产量（96小时）[26]。最近，通过代谢重建甲基和硫供应系统，在仅96小时内实现了7.2 g/L的ERG产量（表S1）[27]。总体而言，这些成就表明大肠杆菌是一个有前途的ERG高产量生产微生物平台。尽管在工程改造ERG生产菌株方面取得了显著进展，但大多数研究主要集中在最大化表达强度或前体供应上，而途径基因剂量、表达平衡与ERG生物合成效率之间的关系仍不明确。特别是，当途径从染色体表达时，增加基因拷贝数是否会导致ERG产量的比例增加尚不清楚，因为表达水平与基因组背景和宿主代谢能力紧密相关。
然而，迄今为止报道的大多数用于ERG生产的大肠杆菌菌株依赖于基于质粒的表达系统[15]、[16]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]，这些系统经常受到遗传不稳定、拷贝数变化和抗生素维持需求的限制[31]、[32]。因此，开发一个无质粒的大肠杆菌平台用于ERG生产是必要的，也是一个关键目标。染色体整合允许精确调控基因拷贝数，并为基因表达提供稳定的基础，无需抗生素。整合基因的表达水平与拷贝数和基因位置密切相关。因此，通过增加基因拷贝数和筛选有利的染色体位点等策略已被广泛用于增强途径表达和产物合成[31]、[33]。然而，通过CRISPR/Cas9方法识别最佳位点并实现多拷贝整合通常既费力又耗时[34]。最近，出现了一种创新的基因组编辑系统——CRISPR相关转座酶，它能够实现精确的多拷贝整合，而不需要双链断裂，也不依赖于同源重组[35]、[36]。Zhang等人将其开发成一种强大的基因组编辑工具，称为多拷贝染色体整合系统（MUCICAT）[37]。重要的是，MUCICAT系统提供了一个独特的机会，可以在遗传稳定的条件下系统地研究染色体基因剂量如何影响多酶生物合成途径的性能。通过快速构建具有精确定义拷贝数的菌株文库，该平台允许定量分析剂量-性能关系，这在基于质粒的系统中由于拷贝数变化和不稳定性而难以实现[37]、[38]。
在这项研究中，我们使用MUCICAT系统在大肠杆菌中构建了一个无质粒的ERG生物合成平台，具有可调节的染色体拷贝数的优化三基因途径。除了实现稳定的ERG生产外，该框架还使我们能够系统地研究基因剂量、途径平衡和ERG产量之间的关系。我们的结果表明，较高的途径拷贝数并不一定会产生更高的ERG产量，因为在代谢平衡的限制下，ERG浓度在一定的拷贝数范围内达到峰值。这些见解为理解和优化染色体编码的ERG生物合成及相关多酶途径提供了概念框架。
部分摘录
质粒构建
本研究中使用的所有质粒列在表S2中。质粒pQCasTns(Ptr)-IS186、pDonorCm(Ptr)（Addgene ID: 175577）和pCutamp（Addgene ID: 140632）由Yang教授提供[37]、[38]。Yang研究中报道的crRNA array8序列由GenScript合成并克隆到pQCasTns (Ptr)中，生成了pQCascade-array8 [38]。质粒pQCasTns (Ptr)-IS3的构建方式相同。
构建了一个包含三个酶的ERG生物合成途径
使用MUCICAT系统进行ERG生物合成途径的多拷贝染色体整合
已建立的基因组编辑工具如CRISPR-Cas9、Cas12a和Cas12f已广泛应用于大肠杆菌中的精确基因组操作[34]、[40]、[41]。尽管这些方法实现了无质粒生产各种化合物，但多基因和多拷贝染色体整合通常依赖于迭代且劳动密集的过程，不适合系统分析广泛的拷贝数范围内的基因剂量效应。CRISPR相关转座酶系统提供了结论
在这项工作中，我们利用MUCICAT系统建立了一种快速高效的策略，用于构建高性能的无质粒大肠杆菌菌株以生产ERG。通过将优化的ERG生物合成盒（Ptac-TcpEgt1-RBSmut8-nocyrM3-T7-mpegtE整合到染色体中，并系统地检查基因组拷贝数的影响，我们确定了菌株P5，该菌株携带五个Ptac-TcpEgt1-RBSmut8-nocyrM3-T7-mpegtE盒的拷贝，实现了222.5 ± 5.0 mg/L的ERG产量。
作者声明
本手稿呈现的是尚未发表或提交给其他地方的原创研究。所有作者均已批准提交，不存在利益冲突。
资助
本工作得到了上海帆船计划（23YF1445800）和上海前沿与跨学科技术领域关键技术研发计划（25JC3201500）的支持。CRediT作者贡献声明
冯美清：写作——审稿与编辑。唐家伟：写作——审稿与编辑，验证。陈少新：写作——审稿与编辑，资金获取。张路文：写作——原始草稿，方法学，调查，数据分析，概念化。利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
