靶向线粒体的工程肽通过抑制由线粒体ROS介导的NF-κB激活，促进肌细胞生成（myogenesis），减轻纤维化（fibrosis），并降低杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy）患者的炎症反应

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Mitochondria-Targeted Engineered Peptide Promotes Myogenesis, Mitigates Fibrosis, and Reduces Inflammation in Duchenne Muscular Dystrophy by Suppressing mitoROS-Mediated NF-κB Activation

针对杜氏肌营养不良（DMD）患者现有治疗手段成本高、副作用多的问题，本研究开发出新型肽类药物E.M.P-2。该药物通过抑制线粒体活性氧（ROS）介导的NF-κB通路，促进肌原细胞分化（上调MyHC/MyoD），抑制纤维化（降低COL1A1表达），并缓解炎症（抑制IL-6/TGFβ），为DMD治疗提供低成本、多靶点替代方案。

　　

Surojit Ghosh | Mohammad Umar Arshi | Satyajit Ghosh | Aniket Jana | Moumita Jash | Juhee Khan | Heera Ram | Kamel Mamchaoui | Surajit Ghosh

印度拉贾斯坦邦焦特布尔印度理工学院跨学科研究平台智能医疗部门，邮编342030

摘要

Duchenne肌肉萎缩症（DMD）是一种严重的X连锁遗传疾病，由dystrophin基因突变引起。目前的治疗主要依赖于皮质类固醇对DMD病理生理症状的管理，但由于高昂的治疗费用，大多数DMD患者无法使用外显子跳跃药物。然而，长期使用皮质类固醇会带来一系列不良反应。为了解决这个问题，我们开发了一种源自促进肌生成的微肽的肽库，并确定了M.P-2作为促进肌生成的候选分子。进一步将M.P-2改造为E.M.P-2，这是一种靶向线粒体的肽，用于应对DMD的继发性病理变化。E.M.P-2在纳摩尔浓度（0.156 μM）下通过上调MyHC和MyoD来促进肌生成，同时抑制纤维化。它能有效螯合钙离子，减少线粒体活性氧（ROS），并维持线粒体膜电位。E.M.P-2还通过抑制IL-6和TGFβ的表达显示出显著的抗炎潜力。其作用机制是通过抑制mitoROS驱动的NF-κB通路激活，从而促进肌生成、抑制纤维化并控制炎症。总体而言，E.M.P-2作为一种基于肽的治疗手段，为DMD提供了比皮质类固醇更安全的替代方案。

引言

Duchenne肌肉萎缩症（DMD）是一种罕见的进行性遗传疾病，由dystrophin基因突变引起，大约每5000名男性新生儿中就有1人患病。该病通常在2至5岁之间被诊断出来，其特征是肌肉逐渐退化，最终导致行走能力丧失。随着疾病进展，呼吸肌和心肌也会受到影响，显著缩短预期寿命，患者往往在二三十年内去世。

DMD是由于dystrophin基因随机突变导致的，该基因是人体最大的基因，包含79个外显子，突变会导致功能性dystrophin蛋白的缺失。dystrophin在肌膜上的dystrophin相关蛋白复合体（DAPC）中起着关键作用，这种复合体将细胞内骨架与细胞外基质连接起来，维持肌肉稳定性并在收缩过程中保护肌膜。dystrophin的缺失会破坏DAPC，导致钙平衡失调、慢性炎症、蛋白酶激活和线粒体功能障碍。这些因素共同导致纤维化、反复坏死、肌肉再生能力受损以及血管适应性下降，使肌肉纤维极易受到收缩损伤，最终引发肌肉退化、脂肪组织替代和早死。

最近DMD的治疗进展包括基因疗法，例如FDA批准的Elevidys，这是一种针对4-5岁儿童的AAV介导的微dystrophin基因疗法。然而，基于AAV的输送方法存在免疫相关毒性、急性肝损伤以及长期转基因稳定性方面的问题。另一种治疗策略是外显子跳跃疗法，但目前只有少数几种获批的反义寡核苷酸（ASO）药物，如Exondys 51、Amondys 45和Viltolarsen。尽管这些疗法具有潜力，但它们的组织摄取效率较低。此外，基因疗法和外显子跳跃疗法都针对特定突变，且费用昂贵，大多数患者难以负担。

为了解决这些问题，本研究旨在开发一种针对DMD进展的继发性病理特征的新疗法，以减少对皮质类固醇的依赖，并为全球DMD患者提供多方面的治疗益处。为此，我们基于一种富含线粒体的微肽（MPM）设计了治疗候选分子E.M.P-2，其在DMD患者的肌肉组织中表达显著下调。为了发挥其治疗潜力，我们系统地从全长56个氨基酸的微肽（MPM）中截短并合成了六个重叠的10个氨基酸肽。

E.M.P-2在纳摩尔浓度下通过上调关键肌生成标志物（如MyoD和MyHC）显著促进肌生成。同时，它通过下调I型胶原（COL1A1）的表达来减轻DMD的典型特征——纤维化。这些促再生和抗纤维化作用是通过抑制TGF-β信号通路实现的，TGF-β是一种已知会损害肌肉再生并促进纤维组织沉积的细胞因子。此外，E.M.P-2还能限制线粒体钙超载，减少活性氧（ROS）的产生，并维持线粒体膜电位，从而减缓疾病进展，为大多数DMD患者提供比皮质类固醇更安全的替代方案。

E.M.P-2还在控制炎症方面发挥作用，炎症是疾病进展的关键病理因素之一。它通过下调促炎细胞因子IL-6的表达来发挥抗炎作用，IL-6在DMD患者中通常过度表达；同时抑制TGFβ的表达，因为TGF-β的长期过度表达会促进纤维化。图1（A和B）展示了E.M.P-2在缓解DMD继发性病理特征中的作用机制。

总体而言，E.M.P-2是一种首创的基于肽的治疗候选分子，旨在针对DMD的多种继发性病理机制，为患者提供比皮质类固醇更安全的治疗选择。

线粒体靶向肽的设计与合成

DMD的主要对症治疗依赖于皮质类固醇，但长期使用会带来不良反应。为了克服对类固醇的依赖，我们通过基于肽的治疗策略来增强肌生成并缓解相关损伤，从而解决疾病的继发性病理因素。

结论

由于外显子跳跃疗法成本高昂且适用范围有限，大多数DMD患者无法使用。因此，有效管理包括肌生成受损、纤维化和慢性炎症在内的继发性病理特征对于延缓疾病进展至关重要。这些方法可以补充针对主要遗传缺陷的疗法，为DMD患者提供更全面的治疗方案。

化学方法

所有起始材料、试剂和溶剂均从商业供应商处购买，未经进一步纯化即使用。质谱数据使用Agilent Technologies公司的电喷雾离子化ESI Q-TOF质谱仪（G6530C）记录。红外光谱使用Bruker FT-IR光谱仪获取。高效液相色谱（HPLC）分析使用Shimadzu C18柱（150 mm × 4.6 mm × 5 μm）进行。

作者贡献声明

Juhee Khan：数据可视化。 Heera Ram：资源提供。 Kamel Mamchaoui：资源提供。 Surajit Ghosh：撰写、审稿与编辑、概念构思。 Mohammad Umar Arshi：撰写、审稿与编辑、可视化、方法设计、数据管理。 Satyajit Ghosh：撰写、审稿与编辑、数据分析。 Aniket Jana：撰写、审稿与编辑、数据分析。 Moumita Jash：撰写、审稿与编辑、数据分析。 Surojit Ghosh：

未引用参考文献

1.; 2.; 15.

数据分析和统计

使用ImageJ软件对点印迹数据进行密度分析。为了清晰起见，图像经过线性增强处理。每个数据点代表n>3个样本，显著性通过单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）或学生t检验计算，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

S.G.和Sa.G.感谢MHRD提供的奖学金。S.G.感谢印度理工学院焦特布尔跨学科研究平台智能医疗部门的支持。M.U.A.感谢CSIR提供的奖学金。A.J.感谢印度政府的PMRF计划提供的奖学金。J.K.感谢DST Inspire提供的奖学金。M.J.感谢SERB India提供的NPDF奖学金。S.G.衷心感谢IIT Jodhpur的Rajsekhar Roy和Nehal Purohit在分子研究方面的宝贵帮助。