雷帕霉素治疗可减少5xFAD小鼠体内的CD11c+小胶质细胞数量，同时增加淀粉样斑块的负荷

《Experimental Neurology》：Rapamycin treatment reduces CD11c+ microglia and increases amyloid plaque load in 5xFAD mice

阿尔茨海默病5xFAD小鼠模型中雷帕霉素长期治疗影响免疫、蛋白酶体活性及Aβ病理，但未改变空间记忆行为。

　　

Koliane Ouk | Francisco Fernández-Klett | Eileen Schormann | Andreas Greiner | Anna Santaella | Camila Fernández-Zapata | Chotima B?ttcher | Elke Krüger | Josef Priller

柏林夏里特大学医学院神经精神病学与分子精神病学实验室，Charitéplatz 1，10117柏林，德国

摘要

哺乳动物雷帕霉素（mTOR）的靶点参与免疫调节以及阿尔茨海默病（AD）中β-淀粉样蛋白（Aβ）和tau肽的代谢。在本研究中，我们探讨了mTOR抑制剂雷帕霉素对5xFAD小鼠模型中中枢和外周免疫系统、蛋白酶体活性、Aβ病理变化以及自发探索行为和空间识别能力的影响。通过流式细胞术分析发现，雷帕霉素改变了5xFAD小鼠的免疫细胞数量和表型，尤其是皮质和海马区CD11c⁺小胶质细胞的显著减少。这与Aβ斑块负荷的增加有关。同时，我们观察到免疫蛋白酶体的含量和活性下降。在外周血中，雷帕霉素处理后粒细胞比例升高，而脾脏T淋巴细胞数量减少。在野生型和5xFAD小鼠中，开放场地测试和改良Y迷宫测试均未发现显著变化。我们的结果表明，雷帕霉素对5xFAD小鼠的Aβ斑块积累和CD11c⁺小胶质细胞亚群具有不利影响，鉴于目前有两项关于雷帕霉素治疗AD的二期临床研究，这一发现具有重要意义。

引言

阿尔茨海默病（AD）占痴呆病例的80%，全球目前有4400万人受此疾病影响（GBD 2019 Dementia Forecasting Collaborators, 2022）。AD是一种神经退行性疾病，晚期表现为记忆缺陷、认知下降和执行功能障碍。遗传学研究表明，家族性AD是由编码淀粉样前体蛋白（APP）和早老素1及2的基因中的错义突变引起的（Weggen和Beher, 2012）。AD的两个神经病理学特征是细胞外Aβ斑块（由聚集的β-淀粉样肽形成）和细胞内神经纤维缠结（主要由过度磷酸化的tau纤维形成）。寡聚态Aβ是神经毒性的主要驱动因素（Broersen等人，2010；Tu等人，2014；Viola和Klein，2015）。中枢神经系统（CNS）中错误折叠蛋白质的积累伴随着小胶质细胞的激活，小胶质细胞是CNS的常驻免疫细胞（Krstic等人，2012）。免疫系统在AD发病机制中的作用得到了进一步证实，因为该疾病与TREM2和CD33等免疫相关基因的突变有关，TREM2的某些变异与AD发病风险增加相关（Ulland等人，2017）。 AD患者大脑中Aβ聚集物和tau蛋白的积累表明，普遍的蛋白质降解机制——泛素蛋白酶体系统（UPS）和自噬功能存在缺陷。UPS对细胞内蛋白质质量控制至关重要，而自噬则通过将大分子聚集物或受损细胞器包裹在双膜囊泡（自噬体）中、使其与溶酶体融合并最终被溶酶体酶降解来发挥作用。这两种细胞蛋白质降解系统对于调节代谢活动和维持稳态、确保细胞存活和生长都是必需的。 哺乳动物雷帕霉素（mTOR）通过抑制营养消耗的合成过程来调控自噬，并且是自噬启动的抑制剂（Zhang等人，2014）。研究表明mTOR参与Aβ和tau的代谢，其信号通路会因Aβ的存在而增强（Li等人，2017）。mTOR在炎症中也起着作用（Srivastava等人，2016；Thomson等人，2009）。重要的是，mTOR的激活对于小胶质细胞在细菌脂多糖或促炎细胞因子刺激下的存活和增殖是必要的（Dello Russo等人，2009）。mTOR由两个功能不同的复合物组成：mTOR复合物1（mTORC1）可被雷帕霉素选择性抑制，而mTOR复合物2（mTORC2）对短期雷帕霉素处理不敏感（Sarbassov等人，2006）。 在AD患者的大脑中也观察到了异常泛素化蛋白质的积累，这表明UPS功能受损。UPS负责清除异常蛋白质、进行蛋白质质量控制，同时还调控许多信号分子（Zhao和Goldberg，2016）。蛋白酶体是UPS的降解装置，由一个桶状20S核心组成，该核心包含两个外α环和两个内β环，每个环有7个亚基，每个亚基又连接着19S调节复合物。在（神经）炎症反应中，会激活一种替代形式的蛋白酶体——免疫蛋白酶体，通过整合β1i/LMP2/PSMB9、β2i/MECL-1/PSMB10和β5i/LMP7/PSMB8三个免疫亚单位来提高蛋白水解能力（Krüger和Kloetzel，2012；Orre等人，2013）。研究还表明免疫蛋白酶体可调控先天免疫信号传导和小胶质细胞的功能（?etin等人，2022）。在AD患者和APP/PS1转基因小鼠模型中都观察到了蛋白酶体异构体的诱导（Mishto等人，2006；Orre等人，2013；Wagner等人，2017）。值得注意的是，mTOR抑制不仅增加了自噬活性，还增强了UPS活性和UPS介导的蛋白质降解（Zhao等人，2015）。 雷帕霉素于1972年被发现，临床上用作免疫抑制剂以防止器官移植排斥反应（Guertin和Sabatini，2009）。雷帕霉素能穿过血脑屏障，通过特异性结合FKBP12蛋白（一种12 kDa的FK 506结合蛋白）抑制mTORC1的磷酸化，从而增加自噬（Stanfel等人，2009）。mTOR的抑制与寿命显著延长相关（Harrison等人，2009；Vellai等人，2003），多项研究证实雷帕霉素不仅可延长野生型小鼠的寿命，还能延缓衰老现象（Richardson等人，2015）。此外，雷帕霉素还能减轻脑损伤模型中的炎症（Erlich等人，2007），提示其具有神经保护作用。目前有两项二期临床试验正在进行或已完成，以评估雷帕霉素在AD中的安全性和有效性（Svensson等人，2024；Svensson等人，2025；Kaeberlein和Galvan，2019）。然而，雷帕霉素治疗AD患者的益处与其潜在副作用仍存在争议。最近的一项研究表明，雷帕霉素处理会下调小胶质细胞中的Trem2表达，减少Aβ清除，并加剧Aβ斑块负荷（Shi等人，2022）。 在本研究中，我们想测试长期使用雷帕霉素对5xFAD小鼠的影响，这种转基因小鼠模型从2个月大开始出现Aβ斑块和胶质增生，并在4-5个月大时出现空间工作记忆障碍（Oakley等人，2006）。 首先，我们在野生型小鼠的器官型脑切片培养（OBSCs）中验证了Aβ沉积对mTOR信号通路的影响，然后评估了长期雷帕霉素处理对5xFAD小鼠中小胶质细胞和外周免疫细胞的影响。我们还测量了5xFAD小鼠大脑中的Aβ负荷以及免疫蛋白酶体的含量和活性。最后，评估了5个月大的5xFAD小鼠在开放场地测试和Y迷宫测试中的自发探索行为和空间识别能力。

器官型脑切片培养和Aβ寡聚体的处理

OBSCs来自出生后3-6天的野生型（WT）小鼠。在异氟醚麻醉和断头后，迅速解剖大脑，分离出大脑半球并去除小脑。将切开的半球表面粘贴在振动切片机（Leica VT1200S）的金属块上，并置于含有冷Hank平衡盐溶液（HBSS）、1%青霉素/链霉素（P/S）、0.6%葡萄糖和20 mM HEPES的缓冲液中，然后用冰冷却的碳酸氢盐溶液冲洗。随后制作矢状切片。

Aβ1–42在OBSCs和5xFAD小鼠中诱导和调节mTOR信号通路

雷帕霉素通过阻断mTORC1信号通路来抑制mTOR，而Aβ则激活该通路（图1A）。第二个复合物mTORC2及其调控的Akt通路仅在长期雷帕霉素处理下被激活。我们首先使用器官型海马脑切片培养（OBSCs）体外分析了寡聚态Aβ1–42（AβO）对mTOR通路的调节作用（p < 0.05；图1B）。通过免疫印迹检测S6磷酸化作为mTOR激活的标志物，我们观察到了随时间变化的mTOR信号通路变化。

讨论

AD是全球最常见的痴呆类型。外围和中枢免疫系统的失调已被认为与AD的发病机制有关（Bettcher等人，2021）。mTOR参与免疫调节以及β-淀粉样蛋白和tau肽的稳态控制，其功能障碍是导致Aβ斑块和神经纤维缠结形成的原因（Davoody等人，2023）。 AD的发病机制仍存在争议，但Aβ级联反应在疾病发展中起着关键作用。

作者贡献声明

Koliane Ouk：撰写初稿、可视化处理、方法学设计、实验实施、数据分析、数据整理。 Francisco Fernández-Klett：方法学设计、实验实施、数据分析。 Eileen Schormann：实验实施、数据分析。 Andreas Greiner：实验实施、数据分析。 Anna Santaella：实验实施、数据分析。 Camila Fernández-Zapata：实验实施、数据分析。 Chotima B?ttcher：方法学设计、实验实施、数据分析。 Elke Krüger：

作者同意声明

我们保证所有作者都已审阅并批准了提交的最终稿件。我们保证本文为作者的原创作品，未在其他地方发表，也未被其他出版机构考虑发表。

资助

本研究部分由柏林健康研究所（Proteostasis Network资助JP和EK）、BMFTR（01EE2303B/01EE2503资助JP）、MRC（UK DRI项目资助JP）以及德国研究基金会（CRC/TRR167资助JP、CB和EK，CRC740资助EK）提供支持。图6中的A和B面板使用Biorender.com工具生成。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢Christian B?ttcher和Jasmin Jamal El-Din提供的优秀技术支持。