盐胁迫驯化的曲霉菌株在鲭鱼内脏发酵中的生物催化潜力：基于高通量测序技术的鱼露微生物群分析

《Food Bioscience》：Biocatalytic potential of salt-stress domesticated Aspergillus strains in mackerel offal fermentation: A High-throughput sequencing-guided analysis of fish sauce microbiota

鱼露发酵中筛选高酶活性曲霉菌株并通过高盐高氮梯度适应优化其耐受性，结合半固态发酵技术缩短周期，提升总酸、氨基酸氮和TBARS含量，核心菌群（葡萄球菌、植物乳杆菌等）协同代谢促进品质，为鱼下脚料高值化利用提供新方法。

李静|黄家博|叶淑红|苏文涛|杜明|江鹏飞

中国大连理工大学食品科学与技术学院，国家海洋食品加工与安全控制工程技术研究中心，SKL实验室，大连116034

摘要

本研究以鲭鱼内脏为原料，探讨了微生物菌株对鱼露发酵过程中物理化学性质及核心微生物群落的影响。通过高盐和高氮梯度适应性筛选出三种具有高酶活性的曲霉菌菌株。与其它组相比，混合曲霉菌发酵产生的鱼露总酸度（增加了14.37%和19.16%）、氨基酸氮（增加了11.67%和3.3%）和硫代巴比妥酸含量均有所提高；该产品品质更优，符合优质鱼露的标准。发酵过程中，所有样品颜色均变为红棕色（非酶促指标增加），pH值呈下降趋势。高通量测序显示葡萄球菌、乳杆菌属、乳酸杆菌属和曲霉菌为核心功能微生物群，它们协同调节氨基酸和碳水化合物代谢，促进高效生物转化，并与物理化学参数变化呈正相关。这些结果拓展了鲭鱼内脏的应用范围，为快速发酵鱼露的生产提供了理论依据。

引言

众所周知，水产品富含蛋白质且脂肪含量低，在全球饮食中具有重要地位（Golden等人，2021年）。目前，几乎一半的可食用产品来自养殖水生生物（Love等人，2023年）。根据粮农组织数据，这些水产品占整个鱼类产量的30%至70%（《2024年世界渔业和水产状况》，2024年），这导致了严重的食物浪费和环境污染。通过将废弃的鱼内脏加工成有用的产品，可以减少食物浪费带来的温室效应，提高食品安全和利用效率（Sandstr?m等人，2022年；Van Zanten等人，2023年）。丝状真菌（如木霉菌、曲霉菌和青霉菌）通过分泌胞外酶（脂肪酶和蛋白酶）有效分解动物废弃物中的复杂有机物。例如，使用鱼内脏作为发酵介质，并接种合适的发酵菌株，通过菌丝网络增加接触面积，与细菌形成共生系统，加速废弃物的矿化（包括将蛋白质转化为氨氮），生成高价值产品。尽管Wang等人（2023年）发现固态发酵可能提高废弃物的营养价值，但由于周期较长（通常超过六个月），商业应用受到限制；Pang等人（2018年）发现液态发酵虽然周期较短但风味不足。结合液态和固态发酵的优点，半固态发酵可以缩短发酵周期，降低加工成本，同时改善产品风味（Ma等人，2019年）。然而，目前尚未有研究系统地将定向驯化技术与半固态发酵的传质优势相结合，以解决上述问题。

鱼露是一种琥珀色、风味丰富的液体，由盐和低品质鱼类制成，经过长时间（通常18至24个月）发酵而成，含有大量营养成分，如维生素B12、谷氨酸和微小肽（Han等人，2023年；Han等人，2023年；Ma等人，2022年）。尽管亚洲市场年消费量超过200万吨，但传统方法依赖自然菌群，导致发酵周期长且风味不稳定。目前鱼露主要采用传统自然发酵工艺，原料包括凤尾鱼、沙丁鱼和多种小型鱼类。发酵过程中涉及多种细菌，微生物组成不明确，生产周期长，产品风味不可预测，存在安全隐患等问题（Ghayoomi等人，2023年）。因此，主要挑战是如何在缩短发酵周期的同时保证鱼露质量。由于发酵初期嗜盐微生物不是优势菌株，需要很长时间适应高盐环境，且某些微生物难以适应高盐和高氮环境，导致微生物种类减少，从而影响鱼露风味。为解决这一问题，本文提出了一种新的“高盐高氮梯度驯化策略”，选择性培育适合工业鱼露生产的优质菌株。该策略模拟鱼露发酵环境，逐步施加盐度和氮源压力，培育出的菌株能显著缩短发酵周期，提升成品鱼露的风味和一致性。

首先，通过引入高盐和高氮环境驯化鱼露发酵菌株，使其适应这种条件。接着将其接种到麸皮中评估发酵性能，最后将其接种到鱼内脏中启动发酵。驯化后，菌株耐盐和耐氮能力显著增强，酶活性保持高水平。因此，其分泌的蛋白酶（包括酸性蛋白酶和中性蛋白酶）活性增加，加速蛋白质分解，缩短发酵周期；鲭鱼内脏富含脂肪，菌株的脂肪酶活性增强，促进脂质分解，产生更多风味化合物。本研究开发的发酵技术有望缩短鱼露生产周期，提高原料利用率。通过为水产品废弃物提供替代加工途径，有助于减少有机废物，促进食品工业的资源高效利用，符合发展可持续和韧性食品生产系统的目标（Maini Rekdal等人，2024年；Springmann等人，2018年）。

菌株驯化

菌株驯化

使用三种不同的曲靖菌株（Huniang 3.042、JY309和Huniang 3.758）进行驯化：在250毫升茄子培养瓶中加入0.1克曲靖菌株，用无菌0.9%盐水稀释至10^6浓度，用接种环涂抹后，在28–30°C下、持续湿度和温度的培养箱中培养五天。经盐水洗涤和甘油保存后，分离出成熟的米曲霉和黑曲霉

米曲霉和黑曲霉的驯化与特性分析

驯化菌株的生长趋势先上升后下降，如表1所示。随着可食用盐和鲭鱼内脏浆的添加，菌株逐渐适应高盐和高氮环境。当可食用盐/内脏液浓度超过30%时，细菌生长速率显著下降（16.6%）。

五天后，将驯化的M1、M2和H菌株接种到PDA平板上，观察其形态变化

讨论

通过高盐和高氮驯化，显著提高了米曲霉和黑曲霉的耐受性，为后续低盐鱼露生产提供了优质起始菌株。在传统鱼露发酵过程中，曲霉菌常面临高渗压应力。高盐浓度会导致细胞膜结构损伤和渗透脱水

结论

在高盐（30% NaCl）和高氮（30%总氮）梯度条件下驯化的米曲霉（CGMCC 3.28627）和黑曲霉（CGMCC 3.28629）与原始菌株在菌落形态、细胞微观结构和超微结构上无显著差异。尽管如此，它们仍保持较高的胞外酶分泌活性。关键酶（包括中性蛋白酶和酸性蛋白酶）的活性也未受影响

CRediT作者贡献声明

黄家博：方法学研究。叶淑红：方法学研究。苏文涛：资源获取。杜明：资金筹措。江鹏飞：写作、审稿与编辑、资金筹措。李静：初稿撰写、数据整理

未引用参考文献

Coenen和Aughton，2002年；Gao等人，2016年；GB 4789，2006年；GB 8276-2006，2006年；GB 12456-2021，2021年；ISO 7393-3，1990年；SB/T 10315-1999，1995年；《2024年世界渔业和水产状况》；Wang等人，2023年。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明没有可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2021YFD2100105）的支持。