《Food Research International》：Efficacy and mechanism of cold plasma-activated lactic acid against
Staphylococcus aureus biofilms
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抗生物膜新型处理剂等离子体活化乳酸酸（PALA）可有效破坏金黄色葡萄球菌生物膜结构，通过膜损伤（68.50%细胞膜受损）、ROS积累（163.09%升高）、EPS分解及表面疏水性降低等多重协同机制实现高效清除（4.10 log CFU/mL）。
廖高豪|杨婷婷|徐珍珍|王佳梅|夏光华|张雪莹|史浩浩|张黎明
中国南海水资源高效利用工程研究中心，海口市海鲜加工重点实验室，海南省食品营养与功能食品重点实验室，海南大学食品科学与工程学院，海口市，海南570228，中国
摘要
由金黄色葡萄球菌（S. aureus）在食品和食品加工表面形成的耐药性生物膜对持续污染、产品变质和公共卫生构成严重威胁。这突显了迫切需要安全、无毒且高效的抗菌生物膜剂。本研究评估了等离子体激活乳酸（PALA）在清除S. aureus生物膜方面的效果及其作用机制。值得注意的是，20分钟的PALA处理使活菌生物膜细胞数量减少了4.10 log CFU/mL，碘化丙啶荧光增加了299.56%，上清液的OD???/OD???比值升高，表明膜结构受到严重破坏且细胞内物质泄漏。流式细胞术显示68.50%的细胞膜受损。此外，PALA还引发了严重的氧化应激，处理15分钟后细胞内ROS水平增加了163.09%。在0–20分钟的处理期间，生物膜细胞中的ATP水平从0.094 μmol/L短暂升高后下降，反映了代谢紊乱。PALA通过多种协同机制发挥其抗菌生物膜作用：破坏生物膜基质结构、导致细胞膜严重损伤和细胞内物质泄漏、显著积累ROS从而引起代谢紊乱以及双链DNA断裂，同时通过抑制自聚作用、降低ζ电位和减少表面疏水性来抑制二次生物膜形成。总体而言，这些发现表明PALA可以有效清除S. aureus生物膜，是一种有前景的新型生物膜控制剂。
引言
近年来，由食源性病原体在食品接触表面形成的耐药性生物膜给食品行业带来了重大的卫生和经济负担。同时，它们对公共卫生构成严重威胁，感染可能导致严重的健康问题甚至死亡风险（Gao等人，2022年）。作为ESKAPE病原体群的一员，金黄色葡萄球菌（S. aureus）是医院感染的主要原因（Santajit等人，2024年；Santajit & Indrawattana，2016年）。在中国，S. aureus污染已出现在多种食品类别中（Xu等人，2012年）。S. aureus能够在多种表面上形成坚固的三维生物膜结构，增强了细菌的自我保护能力，从而增加了食品污染风险（Guo等人，2023年）。生物膜是嵌入多糖、脂质和DNA组成的胞外聚合物物质（EPS）基质中的表面附着微生物群落。这种EPS基质保护细胞免受抗菌剂和宿主免疫防御的攻击（Abdel-Fatah等人，2024年；Hasan & Aggarwal，2025年；Seo等人，2021年）。食品加工过程中的病原体生物膜会导致反复且高水平的污染，对食品安全构成重大威胁（Li, Liang等人，2024年）。因此，迫切需要探索专门针对抑制和去除细菌生物膜的创新策略。
冷等离子体因高效、经济实惠、环境友好和低温特性而在清洁技术中受到重视（Pankaj等人，2014年；Wang等人，2021年）。常压等离子体射流（APPJ）系统通过引入短寿命和长寿命的活性氧（RONs）将水转化为等离子体激活水（PAW），其组成由具体的生成协议严格调控（Han等人，2023年；Wang和Salvi，2021a；Wang和Salvi，2021b；Zhou等人，2020年）。RONs攻击关键生物大分子（如蛋白质、DNA），破坏细胞完整性，导致氧化还原失衡和抗氧化防御机制崩溃（Sheng等人，2024年）。
PAW处理减少了已形成的沙门氏菌生物膜中的功能基因表达、活菌数量和代谢活性（Basiri等人，2023年）。此外，研究表明等离子体激活的纳米气泡水表现出增强的抗菌生物膜活性，处理后生物膜数量减少了2.17 log CFU/cm2（Tiwari等人，2025年）。氧气生成的PAW使成熟大肠杆菌生物膜中的活菌数量减少了6个对数单位，同时导致生物膜细胞内ROS水平升高（Xia等人，2023年）。当用于即食肉类时，PAW提供了微生物食品安全性，同时减少了抗生素抗性的传播（Wang等人，2021年）。研究证实PAW作为广谱食品消毒剂对生物和化学危害具有潜力，使其成为传统消毒剂的可行替代品（Wang等人，2021年）。
具有公认安全（GRAS）状态的有机酸，如乳酸、甲酸和丙酸，被广泛用于食品消毒中的病原体控制（Zhang等人，2025年）。除了作为食品酸剂和防腐剂外，乳酸（LA）现在还应用于制药、化妆品和农业领域（Jodlowski & Strzelec，2021年；Mazzoli等人，2022年）。研究表明LA具有多种抗菌作用。虽然2048 μg/mL的LA可以完全抑制某些弯曲杆菌菌株的浮游生长，但对生物膜的效果有限（Kostoglou, Vass, & Giaouris，2024年）。同时，臭氧水-乳酸联合处理比单独处理更有效地去除聚苯乙烯表面生物膜（Mahdavi & Aliakbarlu，2024年）。与生物膜形式的鼠伤寒沙门氏菌细胞相比，LA对浮游形式的细胞造成更严重的亚致死损伤（Zhang等人，2025年）。LA（2–5%）可以减少微生物污染并延长肉类保质期，但浓度超过1%会损害产品质量（Deumier，2005年；Samelis等人，2001年；Wang等人，2023年）。因此，乳酸表现出显著的抗菌特性。将LA与其他抗菌剂结合使用可以提高其对食源性病原体的效果，并允许使用更低的浓度。在我们之前的研究中，等离子体激活乳酸（PALA）比单独使用乳酸或PAW更有效，在20分钟处理后使单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）减少了4.03 log和对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）降至检测限以下（Cai等人，2023年）。Wang等人（2023年）报告称，10分钟用PALA处理后鲁登假单胞菌
PAW是一种有前景的食品消毒技术。然而，与基于氯的消毒剂类似，其抗菌效果常常受到食品基质中有机物的限制（Byun等人，2021年；Zhao等人，2020年）。比较研究表明，在苹果酸、柠檬酸和醋酸中，乳酸与PAW的协同作用最强，在-80°C下储存30天后仍能保持其抗菌稳定性，并在120分钟后使鲭鱼上的李斯特菌数量减少了4.53 log，且不会影响鱼类质量（Jyung等人，2023年）。PALA为这一问题提供了更好的解决方案。它依靠有机酸和活性氧之间的协同作用。这种组合比单独使用PAW或乳酸更有效地灭活顽固的孢子。具体来说，1%的PALA具有与1.5%的天然乳酸相同的孢子杀灭效果（Wang, Sun等人，2025年）。这种效果源于孢子内膜的破坏。PALA的应用可行性也优于其他激活溶液。例如，等离子体激活的没食子酸会导致肉类变色（Lee等人，2023年）。相比之下，PALA保持了肉制品的感官质量。此外，PALA比传统的基于氯的消毒剂更安全。基于氯的消毒剂处理会产生有毒副产物（Yang等人，2024年）。PALA作为一种清洁标签防腐剂，可以延长水产品的保质期4天，同时保持脂质稳定性（Sheng等人，2024年）。
虽然PALA已证明对浮游微生物有效，并显示出保持食品质量的潜力，但其对耐药性细菌生物膜（尤其是由S. aureus形成的生物膜）的效果仍需进一步研究。本研究系统评估了PALA清除S. aureus生物膜的能力，分析了由此产生的结构和细胞损伤，阐明了其抗菌机制，并评估了处理后生物膜的再生能力。这些发现有望将PALA确立为食品加工环境中环保的生物膜控制策略。
材料
从广东环凯微生物科技有限公司购买了金黄色葡萄球菌（S. aureus）的ATCC 6538菌株。将该菌株以1%的浓度接种到LB培养基中，在37°C和180 rpm的恒温摇床培养过夜，获得对数中期阶段的培养物，细胞浓度约为9 log CFU/mL。将中对数中期阶段的细菌培养物以2:5的比例接种到LB培养基中，在六孔板中培养生物膜
PALA对S. aureus生物膜的效果
图1显示，PALA处理导致OD???值和活S. aureus生物膜细胞数量随时间减少，显著优于其他三组（< /><0.05）。将PALA暴露时间从5分钟延长到20分钟，分别导致活菌数量减少了0.50、1.83、2.70和4.10 log CFU/mL。观察到的生物膜细胞失活可能是由于PALA的双重作用。
结论
本研究显示，与单独使用PAW或LA相比，PALA具有更强的生物膜去除效果，且效果随暴露时间的延长而显著增强。外源性ROS和乳酸诱导的酸应激的共同作用促进了EPS的溶解和膜损伤，促进了大量外源性ROS的渗透和细胞内大分子的泄漏。此外，这种协同作用进一步引发了细胞内ROS的爆发性积累
CRediT作者贡献声明
廖高豪：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。杨婷婷：研究，数据分析。徐珍珍：方法学，研究。王佳梅：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取。夏光华：方法学，研究。张雪莹：数据分析，数据管理。史浩浩：研究，数据管理。张黎明：验证，监督，项目管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32260643）的财政支持。
