《Food Research International》：Structural characterization, function, and mechanism in enhancing WPI emulsion of blackcurrant polysaccharides: From macroscopic emulsion stability to molecular-level interactions by experiments and simulations
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黑加仑多糖（PNBP）及其高压酶解衍生物（PDBP）的结构特性及对乳清蛋白 isolate（WPI）稳定性的影响机制研究。通过HPLC、NMR和甲ylation分析发现，PDBP分子量更低（1.49×10^5 Da vs 2.12×10^6 Da），尿苷酸含量更高，表现出更好的水溶性和稳定性。WPI-PDBP乳液颗粒更小（D[4,3]=2.89±0.14 μm），界面张力（13.05 mN/m）和粘度变化揭示其稳定机制，分子模拟显示PDBP与β-乳球蛋白结合自由能更低（-64.08 vs -56.29 kcal/mol）。
Jingwen Bai|Peng Guo|Bin Yu|Yujia Guo|Siyang Wang|Xueying Bu|Yu Yang
中国黑龙江省哈尔滨市东北农业大学艺术与科学学院，邮编150030
摘要
本研究采用高效液相色谱、核磁共振和甲基化分析技术，全面表征了黑醋栗多糖（PNBP，分子量Mw = 2.12 × 10^6）及其高压辅助酶降解产物（PDBP，分子量Mw = 1.49 × 10^5）的结构。PNBP和PDBP具有相似的主链结构，由重复单元→5)-α-L-Araf-(1→, →4)-α-D-GalAp-(1→和→2,4)-α-L-Rhap-(1→组成，这些结构为静电吸引、氢键作用和疏水相互作用提供了潜在的位点。然而，PDBP由于分子量较低且含有较高比例的尿酸，其水溶性、物理稳定性和流变性能优于PNBP。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜观察结果显示，含有PDBP的乳清蛋白分离物（WPI-PDBP）乳液颗粒尺寸更小（D[4,3] = 2.89 ± 0.14 μm，D50 = 2.14 ± 0.06 μm），表明其分散性和稳定性更优。流变学、界面张力和接触角测量表明，连续相粘度的增加以及界面张力的降低（13.05 mN/m）是WPI-PDBP乳液性能提升的关键因素。此外，紫外光谱、傅里叶变换红外光谱和等温滴定量热分析揭示了多糖与WPI之间的强分子间相互作用，这种相互作用导致WPI发生构象变化，暴露出疏水发色团。分子对接和动力学模拟证实了PDBP-β-乳球蛋白（β-Lg）复合物的高稳定性，其结合自由能为-64.08 kcal/mol（而PNBP-β-Lg复合物为-56.29 kcal/mol）。因此，本研究为天然多糖改善蛋白质乳化性能的分子机制提供了重要见解。
引言
乳液作为一种多相分散体系，能够实现不相溶液体的均匀混合和功能增强，在食品和制药工业中得到广泛应用，通常需要表面活性物质的参与（Chen等人，2022；Cui等人，2024）。乳清蛋白（WPI）是一种常见的两亲性生物聚合物，因其良好的表面活性和在油水界面的快速吸附能力而被认为是一种优异的乳液制备材料（Hu等人，2022；Iqbal等人，2020），并广泛用于食品添加剂中（Lai等人，2022）。然而，其固有的结构和性能限制导致乳液中的液滴容易聚集，影响系统稳定性，难以满足复杂的应用需求（Tian等人，2023）。因此，开发天然稳定剂以增强基于蛋白质的乳液的稳定性变得至关重要。
多种天然稳定剂被用于食品乳液，包括卵磷脂（Dickinson，2015）以及果胶和阿拉伯胶等多糖（Estrada-Fernández等人，2018）。植物来源的多糖因其优异的生物相容性、高安全性和独特的结构特性而备受重视（Huang等人，2024；Xu、Niu等人，2018；Zhang等人，2024）。然而，目前关于多糖增强WPI乳液的研究主要集中在优化其宏观性能上，而对其结构进行清晰系统的表征仍较为缺乏（Albano等人，2019；Lv、Cai、Xv等人，2024）。实际上，阐明多糖的精细结构对于提高实验结果的可重复性和深入理解分子层面的机制至关重要。
黑醋栗（Ribes nigrum L.）因其富含生物活性化合物（尤其是多糖）而受到重视（Duan等人，2020；Xu、Niu等人，2018）。黑醋栗多糖作为这类植物来源聚合物的典型代表，具有显著的益生元作用，能够促进肠道微生物群平衡和代谢健康，并具有潜在的免疫调节功能，有助于调节免疫反应。此外，现有研究表明这些结构复杂的聚合物可以延长乳制品、饮料和化妆品的保质期，从而作为重要的稳定剂和增稠剂（Lv、Cai、Shi等人，2024；Tang & Huang，2022）。然而，目前关于黑醋栗多糖结构表征的研究还不够充分，关于其在WPI乳液中的应用及其作用机制的研究也尚未报道，这严重限制了其作为乳液稳定剂的实际应用。因此，深入理解黑醋栗多糖如何改善乳化性能，特别是通过阐明其结构-功能关系和与其他乳液组分的分子相互作用，对于合理优化其应用潜力至关重要（Huang等人，2024；Xu、Zhang等人，2025）。
本研究通过HPLC、甲基化分析和NMR系统地表征了黑醋栗多糖及其衍生物的结构和功能，并评估了它们在WPI-PNBP/PDBP乳液储存和离子稳定性中的作用。流变分析、界面张力测试和共聚焦激光扫描显微镜用于探讨多糖改善乳液性能的机制。紫外光谱、傅里叶变换红外光谱、热位移测定、荧光猝灭和等温滴定量热分析用于研究多糖与WPI之间的相互作用。分子对接和分子动力学模拟验证了实验结果并提出了作用机制。本研究为类似研究提供了新的见解和方法，为黑醋栗资源的开发和利用奠定了基础。
材料与试剂
根据先前的研究（Xu、Niu等人，2018）提取并初步纯化黑醋栗果实中的天然多糖（NBP）。单糖标准品、右旋糖酐标准品、阿卡波糖、D2O和α-葡萄糖苷酶购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯）。WPI和1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）由Macklin公司（中国上海）提供。十二烷基硫酸钠（SDS）、尼罗蓝和尼罗红染料购自北京Biotopped公司
PNBP和PDBP的理化性质比较
经柱层析纯化后（图S1），PNBP和PDBP的纯度分别为82.14 ± 0.51%和87.32 ± 0.70%，回收率分别为73.65 ± 0.20%和71.98 ± 0.15%（图S2）。
如表1所示，PNBP和PDBP的分子量分别为2.12 × 10^6 Da和1.49 × 10^5 Da（Xu、Gao等人，2018）。此外，PNBP和PDBP在HPLC色谱图中的峰均为单一且对称（图1 A），表明这两种多糖的纯度很高
结论
本研究系统地表征了黑醋栗多糖（PNBP）和降解多糖（PDBP）的结构特征。PDBP的单糖组成与PNBP相似，但分子量较低，糖苷键类型较少，尿酸的摩尔百分比较高。PDBP对WPI乳液的稳定性更优，体现在其时间/离子稳定性、界面性质和液滴稳定性方面的改善
CRediT作者贡献声明
Jingwen Bai：研究、概念构思。Peng Guo：撰写初稿、方法学设计、数据分析。Bin Yu：验证实验结果。Yujia Guo：实验设计。Siyang Wang：软件操作。Xueying Bu：数据分析。Yu Yang：项目管理和监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号32172916）、国家生猪产业技术体系子课题（编号CARS-35-001）和黑龙江省自然科学基金项目（编号LH2021C044）的财政支持。
