红参多糖通过作用于PI3K/AKT/mTOR通路诱导膀胱癌细胞的线粒体凋亡

《International Journal of Biological Macromolecules》：Red ginseng polysaccharide targets the PI3K/AKT/mTOR pathway to induce mitochondrial apoptosis in bladder cancer

红参多糖（RGP）抑制膀胱癌（BLC）细胞增殖并诱导线粒体凋亡，通过调控PI3K/AKT/mTOR通路及BCL-2家族蛋白表达，其机制涉及抑制BAD磷酸化及促凋亡蛋白释放，同时减少氧化应激反应，在动物模型中显示安全性和抗肿瘤活性，为BLC治疗提供新策略。

　　

阿斯玛特·乌拉（Asmat Ullah）|刘秀迪（Xiudi Liu）|曾月涵（Yuehan Zeng）|周传赞（Chuanzan Zhou）|哈鲁恩·伊克巴尔（Haroon Iqbal）|索米娅·谢赫扎迪（Somia Shehzadi）|塞拉格·埃尔丁·I·埃尔贝海里（Serag Eldin I. Elbehairi）|阿里·A·沙蒂（Ali A. Shati）|穆罕默德·Y·阿尔法伊菲（Mohammad Y. Alfaifi）|纳维德·乌拉·汗（Naveed Ullah Khan）|金志敏（Zhi Min Jin）

浙江工业大学药学科学院，中国杭州，310012

摘要

膀胱癌（BLC）是全球第十大常见恶性肿瘤，由于其高昂的个体治疗成本，给医疗系统带来了巨大挑战。这些成本主要源于较长的治疗时间、频繁的随访护理以及对资源密集型侵入性手术的依赖。尽管肿瘤学领域取得了进展，但针对膀胱癌的有效疗法的开发以及患者生活质量的改善仍落后于其他癌症类型，这凸显了需要创新且负担较小的治疗策略的迫切性。为了进一步探讨红参多糖（RGP）在膀胱癌中的作用，本研究评估了RGP在动物模型中抑制肿瘤生长的能力，并阐明了其作用机制。通过实时细胞分析和菌落形成实验研究了RGP对膀胱癌细胞的影响。同时，还利用Western blot分析、免疫荧光染色和流式细胞术分析了其作用机制。结果表明，RGP能够显著抑制膀胱癌细胞的增殖，并呈剂量依赖性下调PI3K亚基的表达。此外，RGP还抑制了下游信号通路（包括AKT/mTOR和PKCα）的活性。它通过调节BCL-2家族蛋白的表达诱导膀胱癌细胞发生线粒体凋亡，从而导致线粒体功能障碍和程序性细胞死亡。这些发现凸显了RGP的临床前潜力，需要进一步开展临床试验以评估其药代动力学、安全性和作为转移性膀胱癌潜在治疗手段的有效性。

引言

癌症是发展中国家和发达国家的主要死亡原因之一。细胞分裂是组织内的基本生物过程，这一过程在稳态条件下主要由凋亡机制调节，实现细胞增殖与程序性细胞死亡之间的精确平衡[1]、[2]。膀胱癌是一种主要的泌尿系统癌症，在全球范围内排名第十位。该病主要影响老年人，男性发病率高于女性。膀胱癌通常起源于膀胱内衬的尿路上皮细胞，尽管也可见鳞状细胞癌和腺癌等罕见亚型[3]、[4]。早期阶段往往无症状，症状通常在疾病进展后才会出现。治疗策略取决于疾病阶段。尽管在治疗方面有所进步，但膀胱癌的复发率仍然很高，需要终身监测。膀胱癌研究中的一个关键问题是识别新的致病途径，以指导新药的开发。自然界中存在许多具有生物活性的化合物，可能对医学有益[5]。利用天然存在的抗肿瘤物质有望推动癌症治疗并取得良好的临床效果。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）控制多种细胞类型的信号通路，在肿瘤生长中起着关键作用。向蛋白质添加磷酸基团并激活AKT/mTOR信号通路对膀胱癌的进展至关重要。PI3K/Akt/mTOR通路是调控肿瘤行为的重要机制，该通路在癌症中经常发生异常。它调控着细胞增殖、细胞周期调节和凋亡等基本过程[6]。研究表明，PI3K/Akt通路的问题在多种癌症（尤其是实体瘤）的发生和发展中起着重要作用，因此针对该通路的不同环节进行干预的研究备受关注[7]、[8]。值得注意的是，PI3K通路的变化解释了某些癌症对标准化疗（如化疗）反应不佳的原因。PI3K/AKT信号通路的异常激活及相关靶点的问题是许多癌症抵抗标准治疗的关键原因。此外，PI3K的下游效应蛋白激酶C能够调节细胞反应，如凋亡和存活[9]。凋亡抵抗与PKC过表达有关，PKC抑制剂正成为使癌细胞对死亡更敏感的有希望的药物[10]。线粒体凋亡在肿瘤进展和耐药性中起着关键作用，尤其是在膀胱癌中，凋亡通路的失调是肿瘤存活和化疗抵抗的标志。这种内在的凋亡通路受BCL2调控[11]、[12]。抗凋亡蛋白（如BCL2和MCL1）在膀胱癌中过度表达，通过抑制BMP和促进BAD、BAX、BAK等促凋亡因子来维持肿瘤细胞的存活。在凋亡刺激下，BAD被AKT磷酸化，使其失活并阻止与BCL2/MCL1的异二聚化。这种PI3K/AKT介导的BAD抑制机制是膀胱癌细胞逃避凋亡的关键途径。细胞色素C和凋亡诱导因子（AIF）释放到细胞质中，触发caspase 3级联反应，进而引发凋亡[13]。在癌症治疗领域，中药及其衍生物作为可行的替代疗法受到了广泛关注。多项研究评估了中药提取物在动物模型、人类细胞系和临床试验中的疗效，结果显示这些提取物在治疗动脉粥样硬化、慢性糖尿病和癌症等多种疾病方面具有显著效果且副作用较低[14]、[15]、[16]、[17]。亚洲数千年来一直将红参（一种属于五加科Panax属的多年生植物）用于药用。红参能有效缓解多种疾病的症状，包括癌症、衰老、疲劳和炎症[18]、[19]。人参中的活性成分包括黄酮类、多酚类、多糖和人参皂苷，其中人参皂苷的活性最强。虽然对人参多糖的药理作用研究较少，但人参皂苷具有多种药理作用。

红参作为一种传统药材，因其所含的生物活性成分（如多糖、人参皂苷和多酚）而被广泛研究其抗癌特性。尽管关于红参多糖（RGP）在膀胱癌中的研究有限，但多项研究表明其在其他类型癌症中具有抗肿瘤作用，这为其在膀胱癌中的潜在疗效提供了有力依据。例如，有研究指出RGP通过下调AQP3抑制PI3K/Akt通路从而诱导胃癌细胞的铁死亡（ferroptosis），表明其能够调节与癌症进展相关的关键信号通路[19]。类似地，另有研究显示RGP通过下调GPX4促进铁死亡，进一步支持其在肿瘤细胞中对抗氧化应激和凋亡的作用[20]。此外，还有研究发现RGP与紫杉醇联合使用可增强巨噬细胞活性并抑制裸鼠体内的黑色素瘤进展，显示出其免疫调节和抗肿瘤潜力[21]。

在泌尿系统癌症中，虽然直接针对RGP在膀胱癌中的作用的研究较少，但其机制（如诱导凋亡、抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路和调节氧化应激）与膀胱癌的病理机制（即PI3/AKT/mTOR通路）一致，该通路在膀胱癌中常发生异常，导致肿瘤生长、存活和耐药性[6]、[22]。鉴于RGP在其他癌症中已证明能靶向这一通路，其在膀胱癌中也可能发挥类似的抗增殖和促凋亡作用。因此，本研究旨在探讨RGP在膀胱癌中的治疗潜力，重点研究其与PI3K/AKT/mTOR通路的相互作用及其诱导线粒体凋亡的能力，从而揭示其作用机制，并评估其作为选择性多靶点治疗膀胱癌的临床前潜力，以满足对更安全、更有效治疗的迫切需求。

材料

红参多糖购自JRDUN生物科技有限公司（中国上海）。N-乙酰半胱氨酸（NAC）购自Sigma公司（美国密苏里州路易斯）。HyClone公司（美国犹他州洛根）提供的RPMI-1640、F-12K和DMEM培养基用于细胞培养。FBS购自ExCell Bio公司（中国上海）。青霉素/链霉素和胰蛋白酶购自Solarbio科技有限公司（中国北京）。结晶紫购自北京化学厂。

RGP抑制膀胱癌细胞的生长并诱导线粒体凋亡

膀胱癌T24和5637细胞在不同浓度（800、400、200、100、50、25、12.5和6.26 μg/mL）下接受RGP处理48小时。MTT实验表明RGP能够以剂量依赖性方式抑制膀胱癌T24和5637细胞（见图1A）。然而，RGP对SV-HUC-1正常尿路上皮细胞没有显著影响，说明RGP主要针对膀胱癌细胞的增殖。RGP在T24细胞、5637细胞和正常对照SV-HUC-1细胞中的IC50值分别为220.2 μg/mL、205 μg/mL和508.1 μg/mL。

讨论

细胞增殖增强和PI3K/AKT/mTOR通路的异常激活是膀胱癌的典型病理特征。虽然药理学上的PI3K抑制剂已显示出临床疗效，但其使用常常受到剂量依赖性毒性、耐药性发展和治疗窗口狭窄的限制[41]、[42]。本研究表明，在体外和体内实验中，RGP通过同时靶向PI3K/Akt/mTOR通路的多个节点，有效抑制了膀胱癌细胞的迁移和增殖。

结论

本研究表明，RGP通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路和诱导线粒体凋亡有效抑制膀胱癌的进展。RGP选择性地作用于膀胱癌细胞，减少其增殖，促进活性氧（ROS）积累和细胞色素C的释放，同时不影响正常尿路上皮细胞。在体内实验中，RGP显著抑制肿瘤生长且无全身毒性，证实了其治疗的安全性和有效性。此外，RGP还通过调节BCL-2家族蛋白和增强氧化应激来发挥作用。

缩写说明

BLC：膀胱癌
RGP：红参多糖
RTCA：实时细胞分析
PI3K：磷脂酰肌醇3-激酶
AKT：蛋白激酶B
PKC：蛋白激酶C
BAD：Bcl-2相关死亡促进因子
BAX：Bcl-2相关X蛋白
BAK：Bcl-2拮抗剂/杀手
MCL-1：髓系细胞白血病1
BCL-2：B细胞淋巴瘤2
ROS：活性氧
NAC：N-乙酰半胱氨酸
EGF：表皮生长因子
Cyt. C：细胞色素C
PARP：聚（ADP-核糖）聚合酶
DCFH-DA：2′,7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯

CRediT作者贡献声明

阿斯玛特·乌拉（Asmat Ullah）：方法学研究、概念构思。 刘秀迪（Xiudi Liu）：方法学研究、数据分析。 曾月涵（Yuehan Zeng）：软件开发、研究设计。 周传赞（Chuanzan Zhou）：资源协调、方法学研究、概念构思。 哈鲁恩·伊克巴尔（Haroon Iqbal）：数据可视化、验证、资源获取。 索米娅·谢赫扎迪（Somia Shehzadi）：数据可视化、验证、资源获取。 塞拉格·埃尔丁·I·埃尔贝海里（Serag Eldin I. Elbehairi）：资源协调、资金获取、数据分析。 阿里·A·沙蒂（Ali A. Shati）：数据可视化、资金获取、数据管理。

参与同意及发表声明

不适用。

伦理批准

本研究方案已获得浙江工业大学动物护理中心的批准，批准编号为20250305005。

资金支持

资金来源：浙江省科学技术厅（项目编号：2021C04021）。作者感谢King Khalid大学科研处通过大型研究项目（项目编号：GRP/13/45）对本研究的支持。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。