重组Filaggrin-2微针通过修复真皮乳头细胞中的线粒体功能障碍，逆转雄激素性脱发

《International Journal of Biological Macromolecules》：Recombinant Filaggrin-2 microneedles reverse androgenetic alopecia by rescuing mitochondrial dysfunction in dermal papilla cells

雄激素性脱发（AGA）由DHT诱导真皮乳头细胞（DPCs）损伤导致毛囊微型化，现有疗法存在靶向单一、透皮差和副作用问题。本研究开发重组Filaggrin 2（rFLG2）通过透明质酸微针系统递送（rFLG2@HA/MNs），在AGA小鼠模型中显著提升毛囊密度、延长生长期，并加速创面愈合。机制上rFLG2通过激活MAPK/Erk通路恢复Bcl-2/Bax平衡及线粒体功能，有效逆转DHT对DPCs的损伤。

　　

常如雪|郝家伟|黄卓颖|张晓瑞|李子怡|吴启宏|唐迅|李一芳|夏欢|邓景贤|杨艳|黄亚东

济南大学细胞生物学系，广州，510632，中国

摘要

雄激素性脱发（AGA）的特征是二氢睾酮（DHT）对真皮乳头细胞（DPCs）的损伤，导致毛囊萎缩。目前的疗法（米诺地尔、非那雄胺）受到单一作用机制、皮肤渗透性差和全身副作用的限制，这突显了创新治疗的迫切需求。在这项研究中，我们发现DHT介导的Filaggrin 2（FLG2）在DPCs中的下调是AGA发病机制的关键因素。为了解决这个问题，我们开发了一种通过透明质酸微针系统（HA/MNs）输送的重组FLG2（rFLG2@HA/MNs），该系统有效促进了毛囊再生并减轻了DHT引起的DPCs损伤。在AGA小鼠模型中，rFLG2@HA/MNs显著增加了毛囊密度并延长了生长期。此外，rFLG2@HA/MNs还促进了未受损毛囊的再生，并加速了全层缺损模型中的伤口愈合，解决了AGA伴随的头皮屏障破坏问题。从机制上讲，DHT会下调DPCs中的FLG2表达；外源性rFLG2通过激活MAPK/Erk信号通路、重新平衡Bcl-2/Bax表达以及恢复线粒体功能，从而挽救了DHT受损的DPCs的活力、迁移能力和黏附性。这些发现强调了rFLG2在毛囊再生中的治疗潜力，确立了FLG2作为AGA治疗的关键靶点，并提供了一种综合策略来对抗DHT引起的DPCs功能障碍。

引言

头发是皮肤系统的重要组成部分，在美学和自尊方面起着重要作用。虽然脱发不会直接威胁生命，但它会严重影响心理健康，常常导致焦虑和抑郁[1]。雄激素性脱发（AGA）是最常见的脱发类型，全球有高达53%的男性和30%的女性受到影响，其特征是毛囊逐渐萎缩和生长期缩短[2]、[3]。目前，米诺地尔（一种血管扩张剂）和非那雄胺（一种雄激素抑制剂）是一线临床治疗方法；然而，它们的效果受到固有缺陷的严重限制：米诺地尔经常引起皮肤刺激，而长期使用非那雄胺与男性勃起功能障碍有关[4]、[5]。因此，迫切需要具有更好生物相容性和最小副作用的新疗法。

为了实现这一目标，必须考虑AGA的发病机制。AGA现在被认为是一种由遗传易感性和雄激素（尤其是二氢睾酮（DHT）驱动的慢性疾病，但其精确的分子基础尚未完全阐明[6]。真皮乳头细胞（DPCs）是毛囊底部的特化间充质细胞，充当毛囊稳态的“指挥中心”。通过与毛囊干细胞（HFSCs）的旁分泌相互作用，DPCs驱动从休止期到生长期的转变并协调皮肤组织修复[7]、[8]、[9]。它们分泌关键的生长因子和形态发生素（Wnt、BMP、FGF、SHH）来激活HFSCs和下游的角质形成细胞，启动毛囊再生周期[10]、[11]。重要的是，DPCs的数量和活性直接决定了毛囊的大小和头发的厚度——DPCs数量越多，促再生信号越强，头发越粗[12]。因此，保护DPCs的功能是逆转AGA的关键前提。

值得注意的是，DPCs的增殖、分化和旁分泌活动高度依赖能量，线粒体通过氧化磷酸化是ATP的主要来源[13]、[14]。新兴证据表明，DHT会严重损害DPCs的线粒体功能：它大幅降低ATP的产生，引发过多的活性氧（ROS）生成，并破坏氧化还原平衡——造成氧化应激状态，从而损伤DNA、蛋白质和细胞膜[15]、[16]、[17]。持续的DHT暴露和氧化应激进一步使细胞凋亡倾向向细胞死亡倾斜：上调促凋亡蛋白（Bax）并下调抗凋亡因子（Bcl-2），增加线粒体外膜通透性，最终导致DPCs凋亡[18]、[19]。虽然抗氧化剂、抗炎剂或促血管生成剂可以抑制AGA模型小鼠DPCs中炎症因子（如IL-6）的分泌，降低ROS水平，从而改善DPCs的生存环境并促进头发生长[20]、[21]、[22]。

Filaggrin 2（FLG2）是皮肤角质层中的关键结构蛋白，属于S100融合型蛋白家族[23]。它在维持表皮屏障完整性和抗菌防御机制中起着重要作用[24]、[25]、[26]。除了表皮层，FLG2还特异性地表达在头皮的毛囊中，在那里它与毛囊干细胞的激活密切相关，并在表皮更新中发挥关键作用[27]、[28]。其蛋白水解片段产生天然保湿因子和抗菌肽，同时维持正常角质化和头发生长所需的酸性pH值[29]、[30]、[31]。增加FLG2的表达可以减轻环境污染物引起的皮肤屏障损伤，并显著缓解头皮屑、发红和瘙痒等症状[32]、[33]、[34]。FLG2缺乏可能导致皮肤屏障功能障碍和毛囊发育异常，如在FLG2缺失的小鼠中观察到的那样[35]。AGA患者的病变区域显示出与皮肤屏障完整性相关的基因下调，包括FLG和FLG2[36]。我们之前的研究进一步表明，重组FLG2（rFLG2）可以缓解紫外线引起的氧化应激，调节IL-1β/IL-10细胞因子平衡，并上调角质形成细胞中的Bcl-2/Bax比例；值得注意的是，rFLG2治疗还增加了小鼠皮肤中的毛囊数量[37]、[38]。然而，FLG2在DPCs中的直接作用——尤其是其对抗DHT损伤的能力——以及其背后的分子机制仍完全不清楚。

通过合理的给药途径将rFLG2（约38 kDa）输送到皮肤真皮层对于研究其在毛囊再生中的作用至关重要。微针（MNs）是一种用于药物输送的微米级针头，长度在500到1000 μm之间[39]。微针作为非侵入性经皮药物输送、疫苗接种、患者监测和疾病诊断工具正在快速发展，具有无痛、微创和易于操作的优势[40]。在各种类型的微针中，可溶解微针由水溶性基质材料支撑，在插入后会被皮肤组织液吸收，具有无需重新插入针头和无需处理锐器的独特优势[41]。透明质酸（HA）是皮肤的天然成分，具有出色的安全性。作为一种可溶解的微针基质材料，它可以通过控制基质材料的溶解速率来调节药物释放，实现精确的药物输送[42]、[43]。它们可以方便地将药物装载到针头基质中，并通过嵌入皮肤的针头尖端的溶解来实现受控释放[44]。这种输送方法保持了蛋白质的结构完整性，并允许受控和持续的药物释放[45]。可溶性微针已被广泛用于大分子蛋白的经皮输送，包括牛血清白蛋白、溶菌酶和葡萄糖氧化酶[46]。使用HA作为微针尖端材料增强了微针的机械强度，提高了皮肤渗透性，改善了性能并确保了出色的生物安全性。重要的是，使用HA作为制造AGA治疗用可溶性微针的介质已经取得了显著的成功[47]、[48]。

在这项研究中，我们制备了具有均匀药物分布、优异机械强度和快速溶解特性的rFLG2@HA/MNs。我们的体内实验表明，rFLG2@HA/MNs在DHT诱导的AGA模型中剂量依赖性地促进了头发生长，其在增加毛囊密度和生长期持续时间方面优于米诺地尔。从机制上讲，我们确认DHT会下调DPCs中的FLG2表达；外源性rFLG2通过激活MAPK/Erk信号通路、重新平衡Bcl-2/Bax表达以及恢复线粒体功能，挽救了DHT受损的DPCs的活力、迁移能力和黏附性。这项研究不仅强调了FLG2作为减轻DHT引起的DPCs损伤的关键靶点，还确立了rFLG2@HA/MNs作为一种安全、高效且有前景的AGA毛囊再生策略。

材料

透明质酸（HA，分子量：100–200 kDa）从MACKLIN（H909935，MACKLIN Biochemical CO., Ltd.，上海，中国）购买。普鲁兰从MACKLIN（(C37H62O30)n）（P816954，MACKLIN，上海，中国）购买。米诺地尔（编号A32346，OKA，北京，中国）和二氢睾酮（DHT）（编号D17576，OKA，北京，中国）从北京Vokai Biotechnology Co., Ltd.购买。荧光异硫氰酸酯（FITC）（3326-32-7，MedChemExpress，Monmouth Junction，NJ，美国）从

rFLG2@HA/MNs的制备和表征

为了促进rFLG2的皮下输送，使用透明质酸（HA）作为基质材料制备了微针（MNs）。通过聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具，以5、10和20 mg/mL的浓度将rFLG2装载到微针中（图1A和B）。扫描电子显微镜（SEM）分析证实了rFLG2在多孔HA网络中的均匀分散（图1C）。微针贴片表现出优异的柔韧性

讨论

传统上，雄激素性脱发（AGA）被认为是由孤立的雄激素过多或血管不足引起的。然而，尽管抑制5α-还原酶或使用血管扩张剂治疗，毛囊周期的萎缩仍然持续存在，这表明需要针对毛囊乳头多细胞微环境的干预措施。在这项研究中，我们发现FLG2不仅是一种结构上的表皮蛋白，还作为主要的调节因子

结论

在这项研究中，我们发现DHT会下调DPCs中的FLG2表达，从而促进AGA的发病机制。通过使用HA/MNs输送的rFLG2，我们有效促进了毛囊再生并减轻了DHT引起的DPCs损伤。在AGA小鼠模型中，rFLG2@HA/MNs显著增加了毛囊密度并延长了生长期。此外，rFLG2@HA/MNs还促进了未受损毛囊的再生，并加速了全层缺损模型中的伤口愈合。

CRediT作者贡献声明

常如雪：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据管理、概念化。郝家伟：监督、方法学、研究、数据管理、概念化。黄卓颖：可视化、资源、方法学。张晓瑞：资源、方法学、正式分析。李子怡：资源、方法学。吴启宏：方法学、研究。唐迅：研究。李一芳：研究。夏欢：监督、方法学。邓景贤：方法学，

伦理批准和参与同意

所有动物实验均按照中国动物护理和使用机构指南进行，并获得了济南大学实验室动物福利和伦理委员会的批准（批准号IACUC-20250801-17）。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究得到了广东省Kea-Area研究与发展计划（编号2022B1111080007）、广州市重点研发计划（编号202103030003）、国家自然科学基金（编号U22A20277、32170865和82071634）以及广东省自然科学基金（编号2022A1515012178）的支持。