用于pH响应药物递送的功能化壳聚糖水凝胶的合成

《International Journal of Biological Macromolecules》：Synthesis of functionalized chitosan hydrogels for pH-responsive drug delivery

本研究通过一步还原胺化法，将烷基链和β-环糊精（βCD）同时修饰到壳聚糖（CS）主链，制备了k-f-CS和βCDk-f-CS水凝胶。通过光谱和流变学表征证实材料成功改性，并加工成多孔海绵。以低水溶性、pH敏感抗生素利福平（RIF）为模型药物，发现修饰后的水凝胶具有高负载能力（平均86.2%±1.3%）和pH响应释放特性（酸性条件缓释率降低37%，中性条件释放率提升至82.4%）。材料在体外表现出良好的血液相容性和抗菌活性，为难溶性药物递送提供了新型协同修饰策略。

　　

Brenda Basiglio | Sergio Román Ribone | Juan Pablo Cerutti | Wout De Leger | Marcela Raquel Longhi | Virginia Aiassa | Mario Smet | Wim Dehaen | Ariana Zoppi

阿根廷科尔多瓦国立大学化学科学学院药学系，UNITEFA-CONICET药学技术研究与发展单元

摘要

基于壳聚糖（CS）的水凝胶因其生物相容性和多功能性而成为药物递送的有前景的平台。然而，其固有的亲水性限制了难溶性药物的包封和持续释放。已经独立探索了化学修饰策略，如N-烷基化和环糊精（CD）共轭，以克服这些限制。然而，此前没有研究通过一步还原胺化过程同时将烷基链和β-环糊精引入壳聚糖中。在本研究中，使用丙酮、丁酮、戊酮、己酮和β-环糊精单醛合成了一系列酮基化壳聚糖（k-f-CS）和β-环糊精/酮基化壳聚糖（βCDk-f-CS）水凝胶。首先通过光谱技术和流变学研究对这些水凝胶进行了表征。随后，将它们制成多孔海绵，并评估了其吸水性能以及利福平（RIF）的装载和释放情况。选择利福平作为模型药物，是因为其溶解度低且在pH值变化时不稳定。这些海绵表现出较高的药物装载能力，并且在酸性条件下具有pH敏感性，导致利福平释放减少，在生理条件下则具有延长的释放曲线。此外，这些水凝胶还表现出血液相容性和抗菌活性。本研究提出了一种新的方法，可以同时用烷基链和β-环糊精修饰壳聚糖，从而获得具有协同特性的水凝胶，用于利福平的包封和控制释放。此外，这些材料还可以制成海绵，便于处理并进一步提高其在先进药物递送应用中的适用性。

引言

水凝胶由于其独特的性质（如高含水量、生物相容性和可调的机械性能）而成为有前景的生物材料，这些性质使它们能够有效模拟生物组织[1]、[2]、[3]。这些三维聚合物网络不溶于水，但由于存在亲水功能基团和聚合物链之间的物理或化学交联，能够吸收大量生物液体[4]、[5]。 在用于制备水凝胶的众多聚合物中，壳聚糖（CS，图1a）因其丰富性（由壳聚糖脱乙酰化获得）、低成本、生物相容性、可生物降解性、无毒性、黏附性和抗菌活性[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]而受到广泛关注。由于其出色的多功能性，壳聚糖可以制成各种形式，包括凝胶、海绵、纤维、薄膜、纳米颗粒和微球[13]、[14]。海绵是干燥的多孔基质，可以轻松重新水化，迅速吸收大量液体同时保持完整性。这种形态使它们能够在干燥状态下装载药物，并随后以可控的方式释放药物，这对于许多药物递送应用非常有利。 从结构上看，壳聚糖是一种线性多糖，由脱乙酰化的D-葡萄糖胺（GlcN）和乙酰化的N-乙酰-D-葡萄糖胺（GlcNAc）单元通过β-(1→4)糖苷键连接而成。其反应性的氨基和羟基允许进行化学修饰，其阳离子性质（pKa ≈ 6.5）使其特别适用于生物医学应用[10]。 尽管具有这些优势，但由于整体亲水性，基于壳聚糖的水凝胶在装载和持续释放难溶性药物方面往往能力有限[15]、[16]、[17]。一种克服这一限制的有前景的策略是对聚合物主链进行化学修饰[18]、[19]、[20]。在这方面，N-烷基化壳聚糖已被研究作为一种增强疏水性和提高机械强度的方法[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。然而，其在药物递送应用中的潜力尚未得到充分探索。 同时，β-环糊精（βCD，图1b）是一种由七个葡萄糖单元组成的环状寡糖，由于其亲水外层和疏水内层，能够与疏水分子形成包合物而受到关注[29]、[30]。据报道，用βCD修饰多糖可以增强通过主客体相互作用的药物装载和释放[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]。然而，大多数报道的系统要么只包含烷基链，要么只包含β-环糊精。据我们所知，尚未有研究通过一步还原胺化过程同时将两者引入壳聚糖中。本研究假设双重修饰可能产生协同效应，从而改善疏水相互作用能力和包合物形成，特别是对于难处理的药物分子。 为了评估这种方法，选择了利福平（RIF，图1c）作为模型药物，因为先前的研究表明它可以部分嵌入β-环糊精的空腔中[40]。利福平是一种广谱抗生素，用于治疗结核病、麻风病和布鲁氏菌病，也被建议用于治疗利什曼病。根据生物药剂学分类系统（BCS），利福平属于II类（溶解度低，渗透性高）药物，在酸性环境中不稳定，会发生显著降解[41]、[42]。其结构包含多个羟基和芳香基团以及酸不稳定基团，这些因素导致其水溶性低和胃部稳定性差。因此，开发能够在酸性环境中保护利福平的药物递送系统是非常必要的。 本研究报道了通过一步还原胺化合成的酮基化壳聚糖（k-f-CS）和β-环糊精/酮基化壳聚糖（βCDk-f-CS）海绵。为了通过还原胺化将β-环糊精共价引入壳聚糖主链，选择性地将β-环糊精氧化为其单醛衍生物（βCD-CHO）。在这种背景下，合成βCD-CHO是为了引入明确的醛官能团，使其能够与功能化的壳聚糖衍生物发生席夫碱反应。这种方法允许在温和条件下实现聚合物网络的共价交联，同时保持β-环糊精空腔的主客体特性。使用不同的酮（丙酮、丁酮、戊酮和己酮）制备了异丙基-壳聚糖（i-f-CS）、丁基-壳聚糖（b-f-CS）、戊基-壳聚糖（p-f-CS）和己基-壳聚糖（h-f-CS），然后与βCD-CHO结合生成βCDi-f-CS、βCDb-f-CS、βCDp-f-CS和βCDh-f-CS。基于功能化壳聚糖的材料已被广泛研究用于药物递送平台[8]、[10]、[18]、[20]。然而，烷基链长度和β-环糊精掺入对水凝胶的物理化学性质及其在药物包封和释放性能的影响尚未系统评估。在本研究中，将不同的酮和βCD-CHO引入壳聚糖主链，并提供了一种双重修饰策略，这是一种新颖且多功能的方法，用于开发能够包封和释放难溶性和pH敏感药物的高级水凝胶。将这种策略与冻干海绵状基质制备相结合，为研究化学功能、网络性质和药物释放行为之间的相互作用提供了一个模块化平台。

材料

壳聚糖（脱乙酰度=90%，分子量=20 kDa）从Glentham Life Sciences（目录代码GC1909）购买，β-环糊精从Sigma-Aldrich（CAS: 7585-39-9）购买。利福平由阿根廷布宜诺斯艾利斯的Parafarm公司提供（CAS: 13292-46-1，纯度：99%）。这些研究中使用的纯化水是通过Milli-Q Water Purification System（Millipore?，贝德福德，美国）生成的。所有溶剂均从Sigma-Aldrich、ACROS或Fisher Scientific购买，所有试剂也来自这些公司。

k-f-CS和βCDk-f-CS水凝胶的合成

基于酮基化壳聚糖（k-f-CS）和β-环糊精-酮基化壳聚糖（βCDk-f-CS）的水凝胶是通过在醋酸缓冲溶液（pH 4.5）中的还原胺化反应合成的，如图1所示。引入酮基团是为了提高壳聚糖的溶解度，因为引入亲水或疏水基团可以改善其水溶性[52]、[53]。选择酮而不是醛是因为酮的反应性较低，这有助于稳定地与壳聚糖共轭。

结论

通过使用βCD-CHO和不同链长的酮进行还原胺化，成功合成了k-f-CS和βCDk-f-CS水凝胶。¹核磁共振（1H NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认了酮和β-环糊精在壳聚糖上的功能化。流变分析表明，所有水凝胶都表现出稳定的凝胶行为。对于k-f-CS水凝胶，增加功能化烷基链的长度导致G′值升高，表明网络更加刚性。

CRediT作者贡献声明

Brenda Basiglio：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，可视化，验证，研究，数据分析。Sergio Román Ribone：撰写 – 审稿与编辑，研究，数据分析，数据分析。Juan Pablo Cerutti：撰写 – 审稿与编辑，研究，数据分析，数据分析。Wout De Leger：方法学，研究。Marcela Raquel Longhi：撰写 – 审稿与编辑，资源获取，资金筹集。Virginia Aiassa：撰写 – 审稿与

未引用的参考文献

[68], [69]

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢西班牙国家科学技术研究委员会（CONICET）、科尔多瓦国立大学（Universidad Nacional de Córdoba）、科学技术研究基金（FONCyT）BID PICT 2021-0272项目以及科尔多瓦国立大学科学和技术秘书处（SECyT）的支持和设施。S.R.R.、M.R.L.、V.A.和A.Z.是CONICET的终身研究成员。