通过金属配位、共价键合和多酚交联诱导的胶原蛋白构象及聚集行为的比较分析

《International Journal of Biological Macromolecules》：Comparative analysis of conformational and aggregation behaviors in collagen induced by metal coordination, covalent, and polyphenol cross-linking

胶原蛋白功能化改性机制及其在环保鞣制中的应用研究。通过系统比较金属配位（Cr3?/Al3?）、共价交联（戊二醛）和天然多酚（EGCG）对胶原蛋白构象和聚集行为的影响，发现EGCG和Cr3?能诱导更稳定的大尺寸聚集体，且EGCG作用更快。研究建立了化学键合-二级结构-聚集的协同作用框架，揭示了不同交联剂调控胶原蛋白稳定性的分子机制。

　　

赵汉楚|吕新迪|庞晓燕|彭亮琼|张文华

四川大学生物质科学与工程学院国家皮革制造清洁技术工程实验室，成都，610065，中国

摘要

胶原蛋白是一种具有生物相容性的三螺旋生物聚合物，在生物医学和工业领域中都是一种基础材料。尽管广泛使用交联策略来增强胶原蛋白的功能，但不同交联剂引起的聚集结构差异仍需进一步研究。本文系统分析了金属配位（Cr(III)/Al(III)）、共价交联（戊二醛，GA）和多酚（表没食子儿茶素没食子酸酯，EGCG）对胶原蛋白溶液构象和聚集形态的影响。CD、FTIR和荧光光谱结果显示，胶原蛋白二级结构的变化顺序为EGCG > Cr(III) > GA > Al(III)。有趣的是，DLS和DSC表明EGCG和Cr(III)导致的胶原蛋白聚集更大且更稳定，尤其是EGCG能够快速诱导胶原蛋白聚集。这些结果揭示了天然植物多酚在制备功能性胶原蛋白生物材料方面的巨大潜力。

引言

胶原蛋白是动物结缔组织的主要成分，具有独特的三链螺旋构象、良好的生物降解性和生物相容性[1]、[2]。它的应用涉及医学、食品、皮革、纺织品等领域。然而，作为一种蛋白质，胶原蛋白对外部因素（如高温或微生物）的耐受性较低。因此，需要使用交联剂来稳定胶原蛋白以适应各种应用。例如，戊二醛（GA）常被用作胶原蛋白生物材料领域的有效交联剂，而现在由于GA的细胞毒性[3]、[4]、[5]，更倾向于使用天然多酚如表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）。在皮革工业中，Cr(III)能够赋予胶原蛋白纤维优异的性能，但目前业界正在积极开发无铬鞣剂，如Al(III)和其他有机化合物，以降低六价铬（Cr(VI)的风险[6]、[7]、[8]。值得注意的是，不同的交联剂会对胶原蛋白的稳定性产生显著影响，这正是当前皮革工业面临的挑战。

实际上，交联剂稳定胶原蛋白的机制引起了广泛关注。典型的交联剂如无机Cr(III)/Al(III)或有机GA通过形成强配位键或共价键来提高胶原蛋白的稳定性，而EGCG则通过弱氢键和疏水相互作用与胶原蛋白相互作用[9]、[10]、[11]。然而，考虑到在胶原蛋白纤维热收缩过程中交联键仍然保持完整，相互作用强度似乎并不主导胶原蛋白的稳定性[12]。胶原蛋白稳定性的来源仍然是一个谜。皮革化学家试图通过吸附热力学来揭示这一本质，并发现胶原蛋白与Cr(III)交联反应时的熵增加比与Al(III)或GA交联时更大[9]、[13]。然而，在复杂的固液皮革制造系统中，很难阐明不同交联剂引起的胶原蛋白结构差异。

通常，均匀溶液中的胶原蛋白分子链具有更高的自由度，这可以通过研究交联过程中的构象变化和聚集行为来直接揭示交联剂对胶原蛋白结构的影响[3]、[14]。虽然与固体纤维基质的稳定性不同，但研究这些溶液相行为可以为理解内在分子相互作用和早期交联机制提供关键见解，这些机制是纤维固化的基础。例如，一些研究人员发现，溶液中胶原蛋白的交联会导致聚集体的形成[14]、[15]。通过调整交联剂的用量可以改变胶原蛋白基质的孔结构和稳定性[16]。然而，尽管已经探讨了单一交联剂对胶原蛋白溶液的改性机制，但针对不同类型交联剂的系统比较研究尚未开展。事实上，各种交联剂如何调节胶原蛋白的聚集和微观结构尚不清楚，而这正是实现胶原蛋白生态友好应用的基础。

本研究通过构建三种类型的交联系统（金属配位（Cr(III)/Al(III)）、共价交联（GA）和多酚组装（EGCG）对胶原蛋白溶液进行了交联。通过建立交联剂类型-浓度-温度的多维策略，分析了胶原蛋白溶液的微观结构，包括二级结构和聚集的变化。此外，还测试了荧光淬灭、热力学参数以及交联过程中的官能团变化。这项工作通过对不同交联剂诱导的胶原蛋白构象和聚集行为的比较分析，为基于胶原蛋白的生物材料的精确设计提供了理论基础。

材料

胶原蛋白来自市场上购买的牛腱。通过盐水浸泡和丙酮萃取去除脂肪和非胶原蛋白，然后在最佳条件下使用醋酸-胃蛋白酶复合物方法提取（m_bovinetendon/m_pepsin = 3:1，pH 3.0，酶消化时间为36小时），再用NaCl盐析纯化得到胶原蛋白（I型，纯度≥95%）。Cr₂(SO₄)₃·6H₂O、Al₂(SO₄)₃·18H₂O和50% GA购自四川科龙化工有限公司（成都）。EGCG购自...

交联剂对胶原蛋白聚集的影响

在三种不同浓度的交联剂条件下，定量监测了蛋白质的平移扩散系数（D_t）和流体动力学半径（R_h），以说明交联剂的类型和剂量对胶原蛋白流体动力学行为的影响（图1）。

所有四种交联剂都降低了胶原蛋白的D_t。其中EGCG系统的影响最为显著，从最初的约2.8×10^?8 cm²/s降低到1.5×10^?8 cm²/s。

结论

通过系统比较金属配位（Cr(III)/Al(III)）、共价相互作用（GA）和多酚复合（EGCG）的交联行为，本研究建立了一个“化学键合–二级结构–聚集”框架，阐明了溶液中胶原蛋白多样化的稳定途径。EGCG诱导的胶原蛋白聚集的表观流体动力学半径R_h最高，其次是Cr(III)，反映了聚集程度和溶剂化的程度。

作者贡献声明

赵汉楚：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，验证，软件使用，实验设计，数据管理。吕新迪：验证，实验设计，数据管理。庞晓燕：撰写 – 审稿与编辑，监督，概念构思。彭亮琼：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源协调，概念构思。张文华：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源协调，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明没有财务利益冲突。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：2227080954）的资助。作者感谢四川大学分析测试中心提供的XPS分析支持，同时感谢严曙光和田云飞的协助。