工程化的G-四聚体适配体-5-氟-2′-脱氧尿苷结合物：尾部方向及RNA间隔序列插入对其结构与抗肿瘤活性的影响

《International Journal of Biological Macromolecules》：Engineering G-quadruplex aptamer-5-fluoro-2′-deoxyuridine conjugates: Impact of tail orientation and RNA spacer insertion on structure and antitumor activity

靶向STAT3的G4适体通过化学修饰优化了抗癌活性，研究显示连接位置和RNA间隔子设计可调控结构平衡与细胞毒性。

　　

Natalia Navarro|Daniela Benigno|Carla Aliberti|Antonella Virgilio|Aldo Galeone|Ramon Eritja|Veronica Esposito|Carme Fàbrega

加泰罗尼亚高等化学研究所（IQAC-CSIC）核酸化学组，巴塞罗那，08034，西班牙

摘要

能够形成G-四链结构的适配体是一类有前景的分子，可用于靶向癌症治疗。然而，它们的治疗潜力常常受到低细胞毒性的限制。为了克服这一限制，人们尝试将其与细胞毒性物质进行化学偶联，尽管优化这类嵌合体的合理策略尚未得到充分发展。为了增强针对STAT3的G-四链适配体（STAT）的活性，我们在其序列的5′端或3′端共价连接了一个由5-氟-2′-脱氧尿苷（FdU）组成的10聚体尾链。结构表征显示，FdU尾链的位置会调节STAT适配体的单体或二聚体形态之间的平衡。这些结构差异显著影响了嵌合体的生物学特性，包括细胞摄取、细胞内转运以及在癌细胞中的体外细胞毒性。此外，在适配体和FdU尾链之间插入RNA间隔序列进一步通过促进降解和前药激活提高了细胞毒性。我们的发现表明，可以通过策略性地利用化疗尾链的性质和位置来调节G-四链适配体的结构构象和生物学功能。这项工作为设计具有可调结构和细胞毒性的适配体-药物偶联物提供了一种合理的设计策略。

引言

能够形成G-四链（G4）结构的核酸适配体因其明确的折叠方式和针对分子靶点的高亲和力而成为一类多用途的治疗剂[1]，[2]。G4适配体通过与核仁素或信号转导和转录激活因子3（STAT3）等蛋白质的相互作用表现出内在的抗增殖效应，而这些蛋白质在肿瘤细胞表面或内部过度表达[3]，[4]。除了通过与参与癌症相关通路的分子靶点的相互作用而产生的内在抗增殖活性外，G4适配体还被研究用于促进其在肿瘤细胞中的摄取或功能参与[6]。虽然像AS1411这样的核仁素结合适配体的受体介导的靶向作用已经得到明确证明[7]，[8]，但其他G4结构也可能在没有明确细胞表面受体的情况下在肿瘤细胞中表现出增强的或优先的内化[9]，[10]，[11]，[12]，[13]。这种内在的生物活性与依赖环境的摄取能力的结合激发了将G4适配体作为抗癌应用平台的探索，包括将其用作治疗载体的支架[14]。尽管具有潜力，但由于细胞毒性较低，G4适配体的临床应用仍然受到限制。

为了克服这些限制，人们探索了各种化学修饰方法来提高适配体的效果[15]，[16]，[17]。其中，引入细胞毒性基团（如小分子[18]，[19]或核苷类似物[20]，[21]）显示出将靶点特异性与强生物活性相结合的巨大潜力。特别是，将抗增殖核苷类似物作为适配体本身的组成部分或通过偶联使用，为构建具有双重功能的适配体提供了独特的机会：靶点识别和抗肿瘤活性[22]。

5-氟-2′-脱氧尿苷（FdU）是一种已知的抗癌剂，它通过体内转化为5-氟-2′-脱氧尿苷单磷酸（FdUMP）来发挥其作用。FdUMP不可逆地抑制胸苷酸合成酶，这是一种在DNA从头合成中的关键酶，导致核苷酸池失衡、DNA片段化，最终导致细胞死亡[23]，[24]。将FdU引入基于DNA的构建物（包括寡核苷酸[25]，[26]、DNA纳米结构[27]，[28]或纳米颗粒[29]）已被证明可以增强抗增殖反应。在这方面，开发了一种新的聚合氟嘧啶寡核苷酸（ODN），由十个连续连接的FdU核苷酸组成，该寡核苷酸在核酸酶介导的降解过程中生成活性代谢物，并表现出显著更高的细胞毒性[24]。

最近，一种能够形成G4结构的适配体已被成功用作FdU的递送载体，在肿瘤细胞中产生了协同的细胞毒性效应[10]。然而，在处理基于G4的系统时，不能仅通过载荷的整合来评估这种混合构建体的治疗潜力，因为形成G4结构的适配体对即使是微小的结构扰动（如添加短核苷酸尾链或化学基团）也非常敏感，这些扰动可能会改变单体、二聚体甚至更高阶构象之间的平衡[30]。因此，治疗单元在核酸支架中的空间排列在构建物的整体结构中起着关键作用，并可能极大地改变适配体在细胞环境中的行为，包括其稳定性、内化机制和细胞内转运。

在形成G4结构的适配体中，AS1411是研究最广泛的例子之一，它因通过与核仁素的相互作用而表现出抗增殖活性而闻名[8]，[31]，以及作为靶向递送策略中的药物载体[32]，[33]，[34]。然而，AS1411的一个主要限制是它在溶液中表现出明显的时间结构多态性[35]，这导致多种G-四链构象的共存以及复杂的结构-功能相关性。除了AS1411之外，还有几种其他形成G4结构的适配体也被报道具有内在的抗增殖效应[1]，[5]，[11]。

在这方面，我们选择了STAT适配体（T40214），因为它能够抑制STAT3（一种在肿瘤发生中起核心作用的转录因子）而展现出有前景的治疗潜力[36]，[37]。STAT3在肿瘤细胞的细胞质和细胞核中通常过度表达并持续激活，在肿瘤组织样本中也是如此，它调节参与肿瘤生长、存活和转移的致癌基因的表达[38]，[39]，[40]。STAT适配体的序列为G₃CG₃CG₃CG₃C，折叠成一个由两个平行排列的G4单元组成的明确二聚体G-四链结构，每个单元由三个G-四联体和三个螺旋形环组成，这些环由胞嘧啶残基构成[41]，[42]。

结合内在的抗增殖活性、针对癌症中经常失调的生物相关信号通路，以及具有较低多态性的可重复G-四链结构，对于机制研究和合理的治疗设计具有重要意义，这为选择STAT适配体提供了明确的理由。

在这里，我们介绍了一系列新的G4适配体-FdU嵌合体的设计和表征，其中10聚体的FdU尾链被共价连接到STAT适配体的5′端或3′端。同时，我们还生成了对照构建体，在同一适配体的5′端或3′端携带10聚体的胸苷序列，作为不含化疗核苷的参考寡聚体，但保持相似的结构长度。通过生物物理和细胞实验，我们研究了FdU尾链在寡聚状态下的位置及其在体外活性中的作用。此外，还评估了在适配体核心和FdU尾链之间插入RNA间隔序列作为增强细胞内降解和前药激活的策略，从而改善了整体的细胞毒性反应。在这方面，还与一个含有DNA连接子的类似构建体进行了直接比较，以评估连接子化学对稳定性和生物性能的影响。上述构建体在表1中有所描述，所有寡核苷酸及其相应特性的综合概述见表S1。

总的来说，这些发现建立了全面的结构-活性关系，并提出了一种通过控制化疗核苷尾链的位置和RNA间隔序列的工程来调节适配体-药物偶联物治疗性能的合理设计策略。

材料与仪器

用于寡核苷酸合成的磷酸酰胺、辅助试剂和溶剂购自Applied Biosystems（美国）和LGC Biosearch Technologies（英国）。标准的自动化固相DNA合成是在K&A H16-SE和K&A H8-SE固相DNA合成仪（K&A Laboratories，德国）上进行的。寡核苷酸纯化柱（OPC）购自Glen Research（NAP-10柱（GE Healthcare，英国））。Hellma?石英玻璃比色皿购自Hellma

结构分析

为了阐明所设计的G4衍生物的结构特征（图1和表1及S1），并评估尾链偶联对其折叠拓扑和超分子组织的影响，进行了生物物理表征。特别是，我们旨在确定在5′端或3′端连接胸苷或FdU片段是否可以调节单体-二聚体平衡并影响G4支架的整体结构稳定性。

CD光谱和UV光谱分析

结论

我们的研究表明，将10聚体的FdU尾链连接到形成G4结构的适配体上显著影响了其结构构象和治疗效果。结构研究表明，在3′端连接FdU序列可以保持二聚体G4结构的形成，这与未修饰的STAT适配体形成5′-5′堆叠二聚体的内在倾向完全一致。相比之下，类似的5′端修饰构建体则主要

CRediT作者贡献声明

Natalia Navarro：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，方法学，研究，形式分析，数据管理，概念化。Daniela Benigno：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，方法学，研究，形式分析，数据管理，概念化。Carla Aliberti：研究，形式分析，数据管理。Antonella Virgilio：撰写 – 审稿与编辑，监督，资金获取，

资助

这项工作得到了西班牙科学创新部（MICINN）（项目PID2020-118145RB-I00和PID2023-148655OB-I00）和欧盟-NextGenerationEU-PNRR MUR-PRIN 2022-[CUP UNINA:E53D23009940006]的支持。N.N.获得了博士前合同资助（PRE2021-097856），CIBER-BBN是由第六个国家研发计划（2008–2011年）资助的Iniciativa Ingenio 2010计划的一部分，CIBER行动，并得到了Carlos III卫生研究所的资助

未引用参考文献

[54]

利益冲突声明

无利益冲突。

致谢

我们感谢ICTS NANBIOSIS寡核苷酸合成平台（U29）的支持。