《International Journal of Biological Macromolecules》：Evolutionary and functional characterization of the chimeric enzyme eliminase (ElmA) in
Escherichia coli K5
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噬菌体与细菌的协同进化驱动了分子创新和遗传多样性。本研究揭示大肠杆菌K5的Eliminase（ElmA）通过水平基因转移重组噬菌体K5A的尾钉解酶KflA和尾纤维蛋白域，形成新型多糖调节酶。结构分析表明其N端结合模块特异性识别肝素硫酸多糖的N-乙酰基，通过热力学 titration测得KD为37.8 μM，可调控多糖层厚度。生理实验证实ElmA作为分子 rheostat 调节多糖外排效率，其截短突变体展示更广底物特异性。该研究首次整合进化、结构和生理分析，阐明噬菌体武器向宿主有益功能的分子驯化机制。
李莉生|李毅|邓建群|曹亚琳|陈一静|蔡一敏|孙久英|盛聚正
天然产物化学生物学重点实验室（教育部），山东大学齐鲁医学院药学院，济南，250012，中国
摘要 噬菌体和细菌之间进行着一场古老的进化军备竞赛，这场竞赛推动了分子创新和遗传多样性。细菌进化出抗性机制，而噬菌体则通过逃逸突变来应对，从而产生了多样的防御和反防御系统。在这种进化框架下，水平基因转移（HGT）使细菌能够获得免疫机制，并将噬菌体衍生的元素重新用于对宿主有益的功能。在这里，我们报道了Eliminase（ElmA）的表征，这是一种存在于大肠杆菌O10:K5(L):H4中的嵌合酶，它通过将噬菌体的武器转化为细菌的防护屏障，体现了这种进化策略。通过综合的系统发育、结构和功能分析，我们证明了ElmA起源于噬菌体K5A的尾刺裂解酶KflA和尾纤维结构域之间的重组——这是一种以前未被记录的机制，它将噬菌体的裂解机制转化为对宿主有益的荚膜调节因子。基因组岛分析将elmA定位在一个来自噬菌体的遗传盒内，而序列比较显示ElmA的N端区域与噬菌体尾纤维蛋白具有高度相似性。等温滴定量热法表明，ElmA的N端结构域与肝素的结合常数为37.8 μM，每个蛋白质分子可以结合大约五个二糖单元。底物特异性分析显示ElmA对肝素有严格的偏好，其活性会因N端位置的修饰而显著降低。使用ElmA缺陷株和过表达株的功能表征揭示了它在荚膜多糖运输中的新调控作用。ElmA促进了低分子量肝素片段的输出，同时控制着荚膜的厚度，起到调节多糖流量的分子变阻器的作用。这些发现揭示了细菌如何利用噬菌体衍生的酶来创建复杂的调控系统，将病毒的裂解机制转化为对宿主有益的功能。
引言 噬菌体和细菌之间进行着一场古老的进化军备竞赛，这场竞赛推动了分子创新和遗传多样性。细菌进化出抗性机制，而噬菌体则通过逃逸突变来应对[1]，[2]。这种共同进化过程产生了多样的防御和反防御系统，噬菌体适应新的细菌基因型，而细菌则通过水平基因转移（HGT）获得免疫机制，形成泛免疫系统——由多个水平获得的免疫元素组成的全面防御网络[3]，[4]。HGT使噬菌体和细菌之间能够交换遗传物质，成为原核生物进化的主要变异来源[3]，[5]。当噬菌体衍生的基因能够提供增强适应性的好处时，如毒力因子、新的酶功能和新陈代谢能力时，它们往往会持续存在于细菌基因组中[6]。然而，除非选择优势超过维护成本，否则外来基因可能会给受体带来负担，导致大多数转移元素的高周转率[3]，[4]。
在这种进化框架下，荚膜多糖是噬菌体-细菌相互作用的关键战场[7]，[8]。细菌荚膜可以作为抵御噬菌体感染、抗菌化合物和宿主免疫反应的保护屏障，而噬菌体则进化出了复杂的机制来穿透这些防御[9]，[10]，[11]。荚膜多糖的临床意义不仅限于噬菌体抗性，因为它们还是许多病原体（如肺炎链球菌[12]、脑膜炎奈瑟菌[13]和致病性大肠杆菌[14]，[15]）的主要毒力因子。荚膜生物合成和修饰系统的动态性质反映了来自噬菌体和宿主免疫系统的持续选择压力。K5噬菌体-大肠杆菌K5系统为研究这些共同进化动态提供了一个极好的模型。大肠杆菌K5产生的肝素荚膜由重复的二糖单元[-4)-GlcA-β(1,4)-GlcNAc-α(1-)组成，既起到保护屏障的作用，也是噬菌体K5A识别的特异性受体[14]，[16]，[17]。为了对抗这种细菌防御，噬菌体K5A编码了尾刺裂解酶KflA，该酶可以结合并分解肝素荚膜，暴露出病毒的进入受体[18]。然而，宿主大肠杆菌K5似乎通过Eliminase（ElmA）扭转了这一进化冲突的局面——这是一个将噬菌体的“剑”转化为宿主“盾”的显著例子。
生物信息学分析显示，ElmA起源于噬菌体的水平基因转移，具有结合噬菌体衍生的酶结构和尾纤维蛋白结构域的嵌合结构。这种基因重组产生了一种酶，其N端结构域与噬菌体尾纤维蛋白具有高度同源性，这引发了关于这种进化遗产是否影响其底物识别特性和在调节细菌致病性中的作用的问题。此外，由于缺乏结构明确的寡糖底物，ElmA的底物特异性尚未得到严格表征，限制了我们对其精确生化功能的理解。在功能分化之后，ElmA的C端结构域的生化特性与KflA有何不同仍不清楚。虽然KflA在噬菌体裂解周期中的作用已经确定[19]，[20]，但在细菌基因组中水平转移的裂解酶的进化命运仍大部分未被探索。
因此，本研究采用了一种综合方法，结合系统发育分析、结构生物化学和细胞生理学，来解决三个关键目标：（1）通过比较序列分析和重组检测，追踪ElmA从其假定的噬菌体起源开始的进化轨迹；（2）通过生化表征定义其N端结构域的结合能力和底物特异性；（3）通过生理和形态学分析阐明其对荚膜多糖的调控作用。这项工作首次对作为一种宿主荚膜调节因子的嵌合尾纤维-尾刺酶进行了综合的进化、结构和生理学表征。通过揭示细菌如何重组和重新利用噬菌体结构域，这项研究揭示了噬菌体到宿主基因驯化的分子机制，并扩展了我们对噬菌体-细菌共同进化中功能可塑性的理解。
序列检索和计算分析 ElmA （GenBank: CAM6662727.1）和
kflA （GenBank:
CAA71133.2 ）的核苷酸序列是从NCBI数据库中检索到的。ElmA（UniProt:
P77039 ）和KflA（UniProt:
O09496 .2）的相应蛋白质序列是从UniProt数据库中获得的。序列比对使用BLASTp和默认参数进行。分子量使用ExPASy肽质量工具计算。蛋白质疏水性谱使用Novopro在线工具分析。
基因组和结构证据证实ElmA的噬菌体起源 在K5噬菌体和大肠杆菌K5相互作用的背景下，我们观察到了一个有趣的案例，涉及功能相似的酶活性。K5噬菌体编码裂解酶基因，而大肠杆菌K5则携带消除酶基因elmA [34]，尽管它们的基因组背景不同，但两者都表现出相似的催化功能。这种功能趋同，加上KflA和ElmA之间的结构相似性，使我们假设elmA 是一个水平获得的基因
结论 这项研究表明，ElmA起源于噬菌体尾纤维-尾刺的重组，代表了病毒机制被进化性地用于细菌荚膜组装的调节。N端的“底物识别模块”通过疏水相互作用实现底物识别，需要肝素上完整的-乙酰基。截短的ElmA234 – 820 变体表现出比全长ElmA更广泛的底物特异性，证实了其模块化功能。
CRediT作者贡献声明 李莉生： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。李毅： 方法学，研究。邓建群： 方法学，研究。曹亚琳： 方法学，研究。陈一静： 方法学，研究。蔡一敏： 软件，研究。孙久英： 方法学，研究。盛聚正： 撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，监督，项目管理，
利益冲突声明 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
这项工作部分得到了中国国家重点研发计划 （2023YFA0914300，资助给JS）、国家自然科学基金 （项目编号22477068，资助给JS）和济南重点研发计划 （202527077，资助给JS）的支持。感谢山东大学药学院的生物功能测试平台提供的仪器和咨询服务，这些支持了对本工作的完成。
