《Journal of Medicinal Chemistry》：Identification and Validation of an Inhibitor of the Protein Kinases PIM and DYRK
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本研究针对已知具有抗癌活性但活性成分不清的发酵小麦胚芽提取物（FWGE），通过分离纯化和化学合成，鉴定了一种新型苯并噻唑类小分子CSH-4044，揭示其可作为选择性靶向PIM和DYRK激酶家族的ATP竞争性抑制剂，并在胰腺癌和神经细胞模型中验证了其抑制BAD和Tau磷酸化的功能，为针对相关疾病的治疗性开发提供了有前景的先导化合物。
在对抗癌症和神经退行性疾病的漫长探索中，科学家们一直在自然界中寻找新的武器。营养保健品（nutraceuticals）因其低毒性和潜在疗效而备受关注，其中，发酵小麦胚芽提取物（Fermented Wheat Germ Extract, FWGE）便是一个有趣的例子。这种在东欧国家已被用于辅助化疗或放疗患者的天然产物，在临床前研究中显示出对肺癌、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌等多种癌症的抗增殖活性。然而，与许多天然提取物一样，FWGE是一个复杂的混合物，其确切的有效成分和作用机制如同一个“黑箱”，限制了其进一步的开发和应用。人们已知其中含有一些苯醌类物质可能贡献了其生物活性，但这很可能只是冰山一角。为了充分利用FWGE的治疗潜力，精确鉴定其核心活性成分并阐明其生化机制，成为了一个关键的科学问题。
与此同时，在细胞信号传导的复杂网络中，蛋白激酶扮演着至关重要的“开关”角色。其中，PIM（Proviral Integration site for Moloney murine leukemia virus）激酶家族和DYRK（Dual-specificity tyrosine-regulated kinase）激酶家族的异常激活与多种疾病密切相关。PIM激酶，特别是PIM3，在胰腺导管腺癌等肿瘤中高表达，通过磷酸化促凋亡蛋白BAD来抑制细胞凋亡，促进肿瘤生长。而DYRK1A则能过度磷酸化Tau蛋白，导致神经纤维缠结的形成，这是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）的关键病理特征之一。因此，开发能够选择性抑制这些激酶的小分子抑制剂，是癌症和神经退行性疾病药物研发的重要方向。那么，能否从FWGE这个天然宝库中，挖掘出能够精准打击这些疾病相关靶点的新颖化合物呢？
为了回答这个问题，一个研究团队在《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了一项研究。他们从FWGE出发，展开了一场从天然产物中“淘金”的探索。研究人员采用生物活性引导的分离策略，对FWGE进行系统的分离纯化。他们首先通过液液萃取、固相萃取（Solid Phase Extraction, SPE）等方法，从冻干的FWGE中富集得到了活性馏分A250。尽管A250仅占FWGE质量的3%，却保留了粗提物的大部分细胞毒性活性。进一步的激酶谱分析（kinase profiling）显示，A250的亚馏分对一组138种激酶具有抑制活性，且抑制作用主要集中在富集亲脂性小分子的乙酸乙酯可溶部分A252。通过对A252的深入细分和活性追踪，研究团队最终锁定了一个名为NDS-2025的高活性浓缩馏分，该馏分显示出对PIM和DYRK激酶家族的高度选择性抑制。
为了找到其中的“明星分子”，研究人员采用了制备型高效液相色谱（preparative High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）、反相HPLC以及与质谱联用的分析型HPLC等一系列色谱技术，从NDS-2025中分离出了亚馏分2025-A、B和C。其中，2025-A对PIM3和DYRK2的抑制活性最强。对2025-A的质谱分析发现了两个主要离子，通过进一步的纯化，得到了活性最高的单一化合物，并命名为F10V6W0。对纯化后的F10V6W0进行激酶谱测试证实，其在1 μM浓度下能特异性抑制PIM和DYRK激酶家族。
接下来，最关键的一步是弄清楚这个神秘分子的“真面目”。研究人员成功培养了F10V6W0的晶体，并通过X射线晶体学（X-ray crystallography）解析了其三维结构。结果显示，F10V6W0是一个全新的苯并噻唑（benzothiazole）类化合物，其化学名称为(2,5-二羟基-4-甲氧基-苯基)-(6-羟基-5-甲氧基-苯并噻唑-2-基)-甲酮，分子量为347.34。数据库检索表明，尽管存在许多分子式相同的化合物，但F10V6W0具有独一无二的结构，是一个从未被报道过的新颖分子。
由于从天然产物中大量获取该化合物较为困难，为了便于后续的功能研究和结构优化，研究团队委托合作方化学合成了该化合物，并将其命名为CSH-4044。通过核磁共振（NMR）波谱和质谱验证，合成产物CSH-4044的结构与天然分离的F10V6W0完全一致。更重要的是，激酶抑制实验表明，合成的CSH-4044完全复制了天然F10V6W0的激酶抑制活性和选择性，两者对PIM3和DYRK2的半数抑制浓度（IC50）均在纳摩尔级别，且数值非常接近，从而在化学和生物学层面都确认了合成路线的成功。
为了在原子层面理解CSH-4044是如何抑制PIM1激酶的，研究人员解析了PIM1蛋白与CSH-4044的复合物晶体结构。结构显示，CSH-4044以扁平的方式结合在PIM1的ATP结合口袋中，是一种ATP竞争性抑制剂。其苯并噻唑环上的5-甲氧基与Lys67形成氢键，6-羟基与Lys67和Asp186的主链酰胺形成氢键。此外，分子周围被多个疏水氨基酸残基包围，并通过水分子介导的网络与蛋白骨架形成额外相互作用。与PIM1结合天然底物AMP-PNP（一种ATP类似物）的结构相比，CSH-4044的结合导致了P环（P-loop）上的Phe49残基发生重排，从而关闭了核苷酸结合口袋，这一特征与另一种激酶抑制剂星形孢菌素（staurosporine）结合PIM1时观察到的现象类似。这些精细的结构信息揭示了CSH-4044与PIM1结合的特异性模式，为基于结构的药物优化提供了蓝图。
最后，研究需要在细胞模型中验证CSH-4044的生物学功能。在胰腺癌细胞模型（MiaPaCa-2细胞）中，CSH-4044处理显著降低了促凋亡蛋白BAD在Ser112位点的磷酸化水平，这与抑制PIM激酶的功能预期一致。在神经细胞模型（SH-SY5Y细胞）中，CSH-4044处理则降低了Tau蛋白在Ser212、Ser202/Thr205和Thr231等多个与阿尔茨海默病相关的位点的磷酸化水平，这表明CSH-4044也能在细胞内有效抑制DYRK1A的活性。这两组实验分别在肿瘤学和神经退行性疾病模型中，有力证实了CSH-4044作为PIM和DYRK双重激酶抑制剂的细胞水平活性。
本研究的主要技术方法包括：1. 生物活性引导的天然产物分离纯化技术，综合运用液液萃取、固相萃取、制备型及分析型高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）联用技术，从发酵小麦胚芽提取物（FWGE）中追踪并分离活性成分。2. 结构鉴定技术，通过X射线晶体学（X-ray crystallography）解析了活性小分子F10V6W0及其与PIM1蛋白复合物的三维结构，并利用核磁共振（NMR）和质谱（MS）验证了化学合成产物CSH-4044的结构。3. 体外活性筛选与验证技术，采用针对138种激酶的谱学分析（kinase profiling）进行选择性筛选，并通过肽基激酶活性测定法（peptide-based kinase assay）测定化合物对PIM3和DYRK2的半数抑制浓度（IC50）。4. 细胞功能验证技术，使用人胰腺癌细胞系MiaPaCa-2和人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y，通过蛋白质免疫印迹（Western blot）检测化合物对下游底物BAD和Tau蛋白磷酸化水平的影响。
研究结果
活性馏分从发酵小麦胚芽提取物中的富集
研究人员从FWGE中富集得到仅占质量3%但保留大部分活性的馏分A250，并将其进一步分离为亲水相A251和亲脂相A252。激酶谱初步筛选发现抑制活性主要集中在A252。
A250来源馏分的激酶选择性谱分析
对A252的亚馏分进行激酶谱（138种激酶）分析，鉴定出馏分NDS-2025对PIM和DYRK激酶家族具有高度选择性抑制活性。进一步分离得到2025-A、B、C三个亚馏分，其中2025-A对PIM3和DYRK2的抑制活性最强。
活性亚馏分的制备型分离
从2025-A中通过制备型HPLC和质谱引导分离，得到了活性化合物F10V6W0。激酶谱分析证实，F10V6W0在1 μM浓度下选择性抑制PIM和DYRK激酶家族。高分辨质谱显示其为一种新颖小分子。
分离的化合物（F10V6W0）是一种具有独特分子结构的苯并噻唑
通过X射线晶体学解析，确定F10V6W0是一种新型苯并噻唑类化合物，即(2,5-二羟基-4-甲氧基-苯基)-(6-羟基-5-甲氧基-苯并噻唑-2-基)-甲酮，分子量为347.34。
CSH-4044的化学合成、结构验证与定量
研究团队成功化学合成了该化合物（命名为CSH-4044），并通过NMR和质谱验证其结构与天然产物F10V6W0一致。激酶抑制实验表明，合成的CSH-4044与天然F10V6W0具有等效的生物活性，均能选择性抑制PIM和DYRK激酶，且IC50值相当。
PIM1-CSH-4044复合物的晶体结构
解析了PIM1与CSH-4044的共晶结构，揭示CSH-4044以ATP竞争性方式结合在PIM1的活性位点。结构显示了关键氢键、疏水相互作用以及水分子介导的相互作用网络，阐明了其结合模式。
CSH-4044在两个细胞模型中抑制PIM和DYRK
在胰腺癌细胞MiaPaCa-2中，CSH-4044处理降低了PIM下游底物BAD在Ser112位点的磷酸化。在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中，CSH-4044处理降低了DYRK1A下游底物Tau蛋白在多个位点（Ser212, Ser202/Thr205, Thr231）的磷酸化。这证实了CSH-4044在疾病相关细胞模型中的功能性激酶抑制活性。
结论与意义
本研究成功地从具有抗癌潜力的天然产物发酵小麦胚芽提取物（FWGE）中，鉴定并表征了一个全新的小分子蛋白激酶抑制剂CSH-4044。该化合物是一种结构新颖的苯并噻唑类分子，能够作为ATP竞争性抑制剂，选择性靶向PIM和DYRK这两个重要的激酶家族。通过化学合成获得了结构与生物活性均与天然产物一致的化合物，解决了天然来源有限的难题。
研究的核心发现具有多重重要意义：首先，它首次揭示了FWGE中除已知苯醌类成分外，还存在具有强效、选择性激酶抑制活性的新颖化学支架，拓宽了对该营养保健品活性成分的认知，并证明了从复杂天然产物混合物中发现全新治疗性先导化合物的可行性。其次，研究通过解析CSH-4044与PIM1的复合物晶体结构，在原子水平阐明了其独特的作用模式，为基于结构的合理药物设计以优化该类抑制剂的效力和选择性提供了关键信息。更重要的是，功能实验证实CSH-4044能够在细胞水平上有效抑制PIM3驱动的BAD磷酸化（与胰腺癌相关）和DYRK1A介导的Tau蛋白磷酸化（与阿尔茨海默病相关），这将其生物学意义从癌症治疗扩展到了神经退行性疾病领域，突显了其作为“一石二鸟”式双重抑制剂的潜在治疗价值。
尽管目前尚无FDA批准的PIM激酶抑制剂上市，但PIM作为癌症治疗靶点的重要性已得到广泛认可。本研究发现的CSH-4044，作为一个源自天然产物的全新化学实体，为开发针对PIM和DYRK激酶驱动的病理过程（如特定癌症和阿尔茨海默病）的治疗药物提供了一个极具前景的先导化合物（lead scaffold）。这项工作不仅推进了对FWGE药用价值的科学理解，也彰显了从营养保健品等天然资源中发现结构独特、生物活性显著的药物先导分子的巨大潜力。
