《Frontiers in Immunology》：A multi-epitope approach for development of a universal vaccine against leptospirosis
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针对当前钩端螺旋体（Leptospira）疫苗保护期短、血清型特异、无法诱导清除性免疫的难题，本研究通过比较泛基因组分析和反向疫苗学策略，鉴定出18个保守的潜在疫苗候选抗原，并设计、合成了一种融合了TLR4激动剂（APPHALS）的多表位疫苗（MEV）。实验证实，该重组MEV能在体外与高免及临床血清强反应，诱导巨噬细胞活化，并在小鼠体内激发稳健的体液和T细胞免疫反应，无需佐剂即可展示出交叉保护潜力，为开发下一代广谱保护的钩端螺旋体病疫苗提供了有前景的候选方案。
钩端螺旋体病是一种被忽视的人畜共患病，由致病性钩端螺旋体引起，在全球范围内造成巨大健康和经济负担。每年预计有超过一百万例感染，严重病例可发展为韦尔病（Weil’s syndrome）或严重肺出血综合征，死亡率可超过70%。在动物中，该病主要导致生殖失败和生产力下降。当前可用的兽用疫苗，如SPIROLET、Vax-Spiral和Nobivac L4，均为基于灭活全细胞菌苗的疫苗。然而，这些疫苗主要依赖脂多糖（LPS），仅能提供短期、血清型特异的免疫力，且不诱导清除性（sterilizing）免疫，其毒性也限制了在人类中的应用。尽管已有多种钩端螺旋体的表面和外膜蛋白被研究作为亚单位疫苗候选，并在动物模型中显示出不同程度的保护效果（40-83%存活率），但它们均未能实现清除性免疫或一致的交叉保护。鉴于钩端螺旋体致病过程中涉及多种表面蛋白，基于单一抗原的疫苗可能不足以提供全面保护。因此，开发一种能诱导长期、广谱交叉保护免疫的有效、无毒疫苗迫在眉睫。近期，发表于《Frontiers in Immunology》上的一项研究，通过整合比较基因组学、反向疫苗学和实验验证，提出了一种新型多表位疫苗（MEV）策略，旨在攻克这一难题。
为开展此项研究，研究人员运用了多个关键技术方法。首先，基于对已测序的所有致病性钩端螺旋体基因组的比较基因组学分析，鉴定了包含2408个基因的软核基因组，并以此为基础进行反向疫苗学筛选。其次，利用一系列生物信息学工具（如PSORTb、TMHMM、SPAAN、VaxiJen、BCPREDs、IEDB工具等）预测抗原的亚细胞定位、跨膜螺旋、粘附素特性、抗原性、B细胞和T细胞表位，并评估人群覆盖率。接着，通过in silico（计算机模拟）工程设计了MEV构建体，利用分子对接和分子动力学模拟评估其与人类TLR4受体的相互作用及稳定性。随后，将优化后的MEV基因在pET28a (+)载体中表达，并在E. coliBL21(DE3)中纯化出重组蛋白。最后，通过一系列in vitro（体外）和in vivo（体内）实验进行验证，包括间接ELISA、显微镜凝集试验、斑点印迹评估MEV的反应性和特异性；用RAW 264.7巨噬细胞系进行细胞刺激实验，通过ELISA、流式细胞术和RT-qPCR分析先天免疫激活；以及用BALB/c小鼠进行免疫原性评估，检测抗体反应、T细胞反应和in vitro生长抑制试验。
3.1 利用反向疫苗学鉴定潜在疫苗候选物
研究人员首先对致病性钩端螺旋体的软核基因组（2408个基因）进行了系统分析。通过亚细胞定位预测，筛选出45个外膜蛋白和13个胞外蛋白。经过跨膜螺旋、粘附素潜力、与人源蛋白同源性、抗原性、过敏原性和保护性抗原性等多轮筛选，最终确定了18个符合所有严格标准的潜在疫苗候选物（PVCs）。对这些候选物进行B细胞和T细胞表位预测，共鉴定出72个高置信度的B细胞表位和大量MHC-I和MHC-II结合表位，其中包括69个能与多个HLA等位基因结合的“混杂性”表位。人群覆盖率分析显示，这些表位在全球、南亚、西南亚（包括印度、沙特阿拉伯）等地区均能覆盖超过90%的人群，其中部分抗原（如WP_011671327）甚至能达到100%的全球覆盖率，证明了其广泛的适用性。
3.2 新型多表位疫苗的构建与评价
基于上述分析，研究人员从中精选了6个抗原（NP_712625, NP_714239, WP_011669637, WP_011670051, WP_011670465, WP_011671327）用于构建多表位疫苗。MEV设计包含了15个选自这些抗原的B细胞、MHC-I和MHC-II表位，并通过合适的连接子（“GGGGS”用于B细胞表位，“GGGS”用于MHC-I表位，“GPGPG”用于MHC-II表位）串联。为了增强免疫激活，在N端通过“EAAAK”连接子融合了TLR4激动剂“APPHALS”作为佐剂。最终构建的MEV包含361个氨基酸，预测分子量约为37.8 kDa。In silico分析表明该蛋白可溶、稳定、非过敏性且具有强抗原性。通过RaptorX和ModRefiner预测并优化了其三级结构，经Ramachandran plot和ProSA-web验证，模型质量良好（90.4%残基位于最优势区，Z-score = -5.67）。分子对接模拟显示MEV能与人类TLR4/MD-2复合物（PDB: 4G8A）稳定结合，全局结合能为-37.63 kcal/mol。随后的分子动力学模拟也证实了复合物的稳定性。
3.3 MEV的反应性和特异性
将设计好的MEV基因合成并克隆到表达载体中，在E. coli中成功表达并纯化出重组MEV蛋白。通过间接ELISA评估其反应性，发现纯化的MEV与显微镜凝集试验（MAT）确诊的钩端螺旋体病患者血清（n=10）以及实验感染L. interrogansserovar Pomona小鼠的高免血清均发生强烈反应，而与其它发热性疾病患者或健康人血清反应微弱，表明MEV具有诊断潜力。显微镜凝集试验和斑点印迹分析进一步证实，抗MEV抗体能够凝集多种致病性钩端螺旋体血清型，并能与包括L. interrogans(Autumnalis, Pyrogenes, Pomona, Icterohaemorrhagiae, Hardjo等)、L. borgpetersenii(Ballum)在内的多种血清型的全细胞裂解物发生交叉反应，显示了其广谱识别能力。
3.4 MEV的先天免疫活性
为了评估MEV激活先天免疫的能力，研究人员用MEV刺激RAW 264.7巨噬细胞。结果发现，MEV能以剂量依赖的方式诱导促炎细胞因子IL-6和TNF-α的产生，且该效应可被蛋白酶K处理消除，而不被多粘菌素B处理影响，说明其活性源于蛋白本身而非内毒素污染。MEV的刺激效果与已知的保护性抗原LigA相当，甚至在某些浓度下更强。流式细胞术分析显示，MEV处理能显著上调巨噬细胞表面共刺激分子（CD80, CD86）和抗原呈递分子（MHC-II）的表达。RT-qPCR分析进一步证实，MEV能强烈诱导多种趋化因子（CCL3, CCL4, CXCL2, CXCL9）、细胞因子（IL-6, TNF-α, IL-1β）以及炎症介质（iNOS, COX-2）基因的表达，呈现出广泛的促炎和免疫激活基因表达谱。
3.5 MEV在小鼠体内的免疫原性
最后，研究人员在BALB/c小鼠模型中评估了MEV的免疫原性。小鼠皮下免疫MEV（加或不加Alum佐剂）后，产生了高滴度的MEV特异性总IgG抗体，并同时诱导了Th1相关亚类（IgG2a, IgG2b）和Th2相关亚类（IgG1）的抗体反应，表明其诱导了混合型的Th1/Th2免疫应答。脾淋巴细胞在MEV刺激下发生剂量依赖性增殖，并分泌Th1细胞因子IFN-γ和Th2细胞因子IL-4，进一步证实了其诱导细胞免疫的能力。尽管添加Alum佐剂并未显著提高抗体滴度，但增强了淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的水平。功能实验显示，抗MEV血清在in vitro生长抑制试验中，能够抑制L. interrogansserovar Pomona的生长，将其活力降至约57%，效果虽略逊于同型高免血清（~42%），但显著优于前免疫血清（~75%），证明了MEV诱导的抗体具有杀菌活性。
研究结论与意义
本研究成功地开发了一种针对钩端螺旋体病的新型多表位疫苗（MEV）。该研究首先通过系统的比较基因组学和反向疫苗学分析，从致病性钩端螺旋体的软核基因组中筛选出18个高度保守、具有强免疫原性的潜在疫苗候选抗原。基于此，研究人员理性设计并构建了一种包含15个B细胞和T细胞表位、并融合了TLR4激动剂APPHALS的MEV。全面的in silico分析预测了MEV良好的稳定性、抗原性及其与TLR4受体的强效结合能力。随后的实验验证表明，重组MEV蛋白能与钩端螺旋体感染者和高免动物血清特异性结合，并识别多种致病性血清型。更重要的是，MEV能够在体外有效激活巨噬细胞，诱导促炎细胞因子产生和共刺激分子上调。在动物模型中，MEV即使在不使用佐剂的情况下，也能激发稳健的体液免疫（产生高滴度、具有交叉反应性的抗体）和细胞免疫（诱导T细胞增殖和Th1/Th2细胞因子分泌），并且所诱导的抗体显示出in vitro杀菌活性。
这项研究的核心意义在于，它首次报道了一种针对钩端螺旋体病的、基于全基因组范围抗原优先排序并经过实验验证的多表位疫苗。与以往大多局限于计算机预测或仅针对少数已知抗原的研究不同，本研究整合了从基因组到表位的系统筛选、结构验证以及先天性和适应性免疫反应的实验评估，提供了一条开发下一代疫苗的完整路径。MEV所展示的强免疫原性、交叉反应性和免疫刺激能力，使其成为一个极具潜力的通用钩端螺旋体病疫苗候选者，为最终实现能够提供长期、广谱交叉保护、甚至清除性免疫的疫苗目标迈出了关键一步。这项工作不仅为钩端螺旋体病的防控提供了新思路，其整合生物信息学、结构生物学和免疫学实验的研究策略，也对其他复杂病原体的疫苗研发具有重要的借鉴价值。
