《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》：KLRG1 defines a distinct tumor-infiltrating granzyme K+ CD8?+?T cell population
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为阐明肿瘤浸润CD8+ T细胞中GZMK+效应亚群的功能及分离难题，本研究通过整合单细胞测序与高维流式分析，揭示了KLRG1可作为其特异性表面标记物，并验证了KLRG1、CD39、CD55分别用于分离GZMK+效应细胞、功能障碍效应细胞和干细胞样细胞的有效性，为深入解析该关键亚群在肿瘤免疫中的作用提供了关键技术平台。
在人类与癌症的漫长斗争中，免疫系统一直是我们最强大的盟友之一。特别是肿瘤微环境中的CD8+ T细胞，它们如同深入敌后的特种部队，负责识别并清除癌细胞。随着免疫疗法的兴起，特别是针对PD-1等免疫检查点的抑制剂，我们已经见证了许多晚期癌症患者重获新生的奇迹。然而，并非所有士兵都处于最佳战斗状态。科学研究早已揭示，肿瘤内部的CD8+ T细胞并非铁板一块，而是一个高度异质化的群体。其中，一部分细胞因持续受到肿瘤抗原刺激而变得“精疲力竭”，成为功能失调的效应细胞；另一部分则保持着“干性”，像预备队一样具备增殖和分化的潜力。除此之外，还有第三股不可忽视的力量——大量表达颗粒酶K的CD8+ T细胞，它们广泛存在于多种癌症类型中，却像一个神秘的“影子军团”，其真实身份、来源和战斗任务至今模糊不清。
这个“影子军团”的学名是GZMK+效应T细胞。尽管它们在肿瘤浸润淋巴细胞中占据了相当大的比例，但科学家们对其知之甚少。传统观点认为它们可能是功能失调细胞的前体，或是功能不明确的过渡状态。更棘手的是，与功能失调细胞（常用CD39等标记物）和干细胞样细胞（常用TCF7等标记物）不同，GZMK+效应细胞缺乏独特且可靠的细胞表面蛋白标记物。这就像一个士兵没有佩戴特殊的肩章或徽记，使得研究人员无法在纷乱的肿瘤战场中将它们精准地“活捉”出来，进行单独的研究和功能测试。没有分离，就没有深入的功能表征；没有表征，就无从知晓它们在抗肿瘤免疫中是敌是友，是助力还是阻力。这个关键的空白，严重阻碍了我们对肿瘤免疫微环境的全面理解，也限制了我们开发更精准免疫治疗策略的可能。
为了解决这一核心难题，一项发表于《Journal of Cancer Research and Clinical Oncology》的研究应运而生。研究人员决心揭开GZMK+效应细胞的神秘面纱，首要任务就是为它们找到一张专属的“身份证”——能够用于活细胞分选的表面标记物。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，他们整合了来自头颈鳞状细胞癌和非小细胞肺癌患者、经过抗PD-1治疗的两个队列的单细胞RNA测序公共数据集，构建了一个包含超过28万个细胞的肿瘤浸润CD8+ T细胞图谱。其次，利用生物信息学方法进行了差异基因表达、基因集富集分析和轨迹推断。最后，基于计算筛选出的候选表面标记物，研究人员收集了原发性人头颈肿瘤样本，通过高维流式细胞术进行了实验验证，以确认标记物在蛋白水平的分选效能。
单细胞RNA测序揭示CD8+ TILs三大核心亚群
研究人员首先对整合后的单细胞数据进行分析，成功描绘了肿瘤浸润CD8+ T细胞的转录全景图。他们共鉴定出12个不同的T细胞亚群，但其中三个群体占据了绝对主导地位，并且在几乎所有患者的肿瘤样本中都稳定存在，不受肿瘤类型是头颈癌还是肺癌的影响。这三个核心群体分别是：干细胞样细胞、功能失调效应细胞和GZMK+效应细胞。通过计算预设的“干性”、“效应功能”、“耗竭”和“增殖”基因评分，他们确认了这三个群体的基本特征：干细胞样细胞具有高干性、低效应和耗竭水平；功能失调效应细胞则表现出高效应活性和高耗竭状态；而GZMK+效应细胞呈现出一种独特的中间表型，具有中等干性评分，但效应、耗竭和增殖评分都较低。
GZMK+效应细胞具有独特的、未被定义的转录特征
为了深入理解这三个群体的功能，研究人员进行了差异表达基因分析和基因集富集分析。结果非常有趣：功能失调效应细胞显著富集于细胞毒性、效应功能和相关信号通路；干细胞样细胞则富集于记忆/初始T细胞相关的基因集。然而，GZMK+效应细胞却几乎没有任何显著富集的已知功能基因集，仅有9个基因集呈阳性富集，且没有明确的生物学主题。这强烈提示，GZMK+效应细胞并非简单地是功能失调细胞的前体或一个过渡状态，而是一个具有独特生物学功能的、尚未被明确定义的细胞亚群。
轨迹分析揭示独立的分化路径
为了探究这些细胞间的发育关系，研究人员进行了伪时间轨迹分析。分析结果进一步支持了GZMK+效应细胞的独特性。轨迹显示存在两条主要的分化路径：一条是干细胞样细胞 -> GZMK+效应细胞 -> CX3CR1+效应细胞；另一条是干细胞样细胞 -> 功能失调效应细胞 -> 增殖细胞。值得注意的是，GZMK+效应细胞主要流向CX3CR1+效应细胞，而不是功能失调效应细胞，这与之前认为它是“前耗竭”状态的观点不同，提示它可能走向一个不同的终末分化命运。
鉴定并验证KLRG1为GZMK+效应细胞特异性表面标记物
本研究的核心目标是找到可用于分选的表面标记物。研究人员从差异表达基因中筛选出那些编码细胞表面蛋白的基因，并通过受试者工作特征曲线分析评估其区分不同亚群的能力。最终，他们锁定了三个高区分度的候选者：KLRG1 用于GZMK+效应细胞，ENTPD1 用于功能失调效应细胞，CD55 用于干细胞样细胞。其中，KLRG1在区分GZMK+效应细胞与其他主要亚群时表现出很高的敏感性和特异性。
计算结果的可靠性需要在真实的肿瘤样本中得到验证。研究人员收集了5例原发性人头颈鳞癌标本，制备成单细胞悬液，使用包含CD3、CD8、KLRG1、CD39、CD55以及胞内颗粒酶K和颗粒酶B抗体的多色流式 panel 进行分析。结果令人振奋：在蛋白水平上，KLRG1蛋白的表达与GZMK蛋白的表达显著正相关；同样，CD39与GZMB正相关，CD55与颗粒酶阴性细胞相关。更重要的是，分选验证显示：KLRG1+细胞中GZMK+细胞的比例显著富集；CD39+细胞富集GZMB+细胞；CD55+细胞富集颗粒酶双阴性细胞。这证明，仅通过KLRG1、CD39和CD55这三个表面标记物，就能有效地从患者肿瘤样本中分别活体富集出GZMK+效应细胞、功能失调效应细胞和干细胞样细胞，即使这些细胞在起始样本中的比例很低。
研究结论与意义
综上所述，这项研究系统性地描绘了肿瘤浸润CD8+ T细胞的异质性图谱，并成功解决了该领域的一个关键瓶颈问题。研究的主要结论是：第一，GZMK+效应细胞是肿瘤微环境中一个主要的、但功能特征独特的CD8+T细胞亚群，其转录谱不同于经典的功能失调或干细胞样状态。第二，该细胞群体并非简单地是功能失调细胞的前体，轨迹分析提示其可能通过独立的分化路径，最终形成CX3CR1+效应细胞。第三，也是最重要的实践贡献，研究首次鉴定并验证了KLRG1可作为GZMK+效应细胞高度特异性的表面标记物，同时确认CD39和CD55可分别用于分选功能失调效应细胞和干细胞样细胞。
这项研究的意义重大。它不仅仅是为一个神秘的细胞亚群贴上了“标签”，更是为整个肿瘤免疫学领域打开了一扇新的大门。在此之前，由于缺乏分离手段，对GZMK+效应细胞的功能研究几乎无法开展。现在，凭借KLRG1这个“分子钩子”，研究人员可以首次从患者肿瘤中纯化出这群细胞，进行一系列此前不可能完成的研究：例如，测试它们对肿瘤细胞的直接杀伤能力；分析它们分泌的细胞因子谱；研究它们与肿瘤微环境中其他免疫细胞或癌细胞的相互作用；甚至评估它们在免疫治疗响应或耐药中的作用。这将极大深化我们对肿瘤免疫微环境复杂性的理解，并可能揭示新的免疫治疗靶点或生物标志物。该研究建立了一个强大的技术平台，使得在蛋白质水平上对这群关键细胞进行分离和功能评估成为可能，为最终阐明它们在癌症发生、发展和治疗中的作用奠定了坚实基础。
