《Animal Research and One Health》：Developmental Characteristics of the Embryonic Liver Tissue and Long-Term Culture of Primary Hepatocytes in Duck
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为解决家禽尤其鸭胚胎期肝发育研究缺乏，以及鸭胚肝细胞体外增殖受限、易发生上皮-间质转化（EMT）而难以长期维持功能和特征等难题，本研究系统探究了鸭胚肝组织（E5~E26天）的结构、脂滴累积与细胞器发育特征，并筛选出以Medium 9和Medium 9-a为代表的高效培养体系，显著促进了肝细胞体外增殖与功能维持。这为鸭肝功能和营养代谢的后续研究提供了宝贵见解和有力的细胞工具。
肝，这个体内繁忙的“化工厂”和“解毒中心”，不仅是机体发育研究的绝佳模型，更是探索疾病抵抗机制的关键器官。在禽类中，肝脏还扮演着独特的角色，尤其是对于以高脂沉积能力著称的鸭而言，它是脂肪合成的主要场所，堪称研究脂质代谢的宝藏模型。然而，目前关于哺乳动物肝脏发育的研究已较为深入，聚焦于鸭，特别是其胚胎期肝脏发育的探索却依然寥寥。这就像我们拥有一幅哺乳动物肝脏发育的精细地图，但禽类，尤其是鸭的这张地图上，却仍有大片空白等待填补。此外，尽管鸭胚肝细胞能够成功分离，但其体外扩增却是一大挑战。肝细胞是终末分化细胞，通常处于静息状态，在体外培养时不仅增殖困难，还容易“变脸”——发生上皮-间质转化（EMT），转化为非实质细胞，从而丧失其宝贵的肝细胞特性和功能。这些问题严重阻碍了在细胞层面深入探究鸭肝功能和代谢机制的步伐。为了阐明鸭胚胎肝脏的发育蓝图，并建立一个能够长期维持肝细胞特性的强大体外培养工具，Jie Wei、Jing Tang等研究人员在《Animal Research and One Health》杂志上发表了一项系统性研究。
为了回答上述科学问题，研究者综合运用了多项关键实验技术。在组织学层面，他们对5至26天（E5-E26）的鸭胚肝组织进行了苏木精-伊红（HE）染色、油红O染色以及透射电子显微镜（TEM）观察，以解析肝脏的结构成熟、脂滴累积及细胞器超微结构的动态变化。在细胞培养与功能评估方面，他们从候选的5种基础培养液（Medium 5C，即包含FSK、SB431542、DAPT、IWP2、LDN193189五种小分子化合物）出发，通过调整添加细胞因子（如肝细胞生长因子HGF、肿瘤坏死因子-α TNF-α、白介素-6 IL-6等）和不同浓度血清，共设计并比较了多达11种不同的培养基配方。通过评估肝细胞的形态、密度、生长状态、生化指标（白蛋白ALB、天冬氨酸氨基转移酶AST、乳酸脱氢酶LDH）、生理功能指标（肝糖原HG含量）、以及通过免疫荧光法测定白蛋白（ALB）表达以鉴定细胞纯度和功能，最终筛选出最优的体外培养条件。
3.1 鸭胚肝结构成熟
研究发现，鸭胚肝发育特征主要表现为肝细胞数量增加、肝索（HC）延伸、肝窦（LS）数量增多而面积减小、肝内多种血管形成以及肝功能的渐进性增强。在E5天，肝脏尚无明显的肝小叶（HL）结构，肝索开始形成，肝窦较宽。从E6至E9天，肝索数量逐渐增加。从E10至E17天，肝小叶结构开始出现并持续发育，中央静脉（CV）更明显。至E14天，中央静脉、小叶间静脉（IV）、小叶间动脉（IA）和小叶间胆管（IB）均清晰可辨，标志着肝小叶分化完成。从E20至E26天，肝小叶数量急剧增加达到高峰，肝索密度升高，尺寸显著减小。
3.2 鸭胚肝脂滴发育
在胚胎发育过程中，肝细胞内的脂滴（LD）数量明显增加，反映了肝脏脂质代谢的增强。从E5到E8天，未见明显脂滴。从E11到E17天，开始出现少量微小脂滴。从E20到E26天，脂滴的数量和体积均显著增加，染色加深，分布密集，几乎充满整个肝组织结构。
3.3 肝细胞细胞器与脂滴的发育
鸭胚肝细胞的发育变化主要表现为细胞器类型和数量的改变，以及脂滴的形成。从E5到E8天，线粒体数量逐渐增加，嵴清晰；粗面内质网（RER）呈带状环绕线粒体。从E11到E17天，线粒体和RER数量持续增加，线粒体嵴变得不清晰，脂滴开始出现。在E20天，线粒体和RER密度仍呈增加趋势，但线粒体嵴难以分辨，大量脂滴出现。从E23到E26天，肝细胞边界不完整，线粒体和RER数量锐减，大量脂滴占据了肝细胞的相当大部分。
3.4 6个培养组细胞状态比较分析
基于Medium 5C（即Group 5）配制的6个培养组比较发现，在培养48小时时，Group 4和5的肝细胞团簇更大、状态更好。随着培养时间延长至144小时，Group 1发生明显EMT，Group 2、3、6中非实质细胞更突出，而Group 5的肝细胞团簇保持良好，无明显非实质细胞。这证实了5C培养系统能有效维持鸭胚肝细胞特征。
3.5 15种培养基比较分析
通过检测15种不同培养基上清液中的生化指标，发现白蛋白（ALB）含量在1-6天培养期间相对稳定，其中Medium 1的ALB含量始终最高。天冬氨酸氨基转移酶（AST）和乳酸脱氢酶（LDH）含量随时间推移均逐渐下降并最终稳定在低水平，比较分析显示Medium 3、7、9、11的AST和LDH值较低。综合ALB、AST、LDH指标，最终筛选出Medium 1、3、7、9、11这5种培养基作为候选进行下一步优化。
3.6 5种候选培养基中肝糖原表达
通过高碘酸-希夫（PAS）染色评估肝糖原（HG）含量发现，在48、96、144小时，5种培养基的染色面积和颜色深度存在显著差异。Medium 9在不同培养时间均表现出最高的肝糖原比例，表明其更能有效增强肝细胞功能。
3.7 5种候选培养基中白蛋白表达
免疫荧光法测定白蛋白（ALB）表达的结果显示，所有5种培养基在不同培养时间点的肝细胞纯度均超过95%。Medium 9的肝细胞密度和ALB表达强度最为显著，其纯度超过98%，高于先前报道的鸭肝细胞纯度（>95%）。
3.8 5种候选培养基中肝细胞生长特性
生长曲线分析显示，5种候选培养基的肝细胞生长存在显著差异。在整个培养期间，Medium 1的肝细胞数量始终保持较高水平，而Medium 9持续增长，最终与Medium 1的生长曲线相交并显示出进一步增加的趋势。结合肝糖原染色和免疫荧光结果，确定Medium 1和9是最适合进一步优化的培养基。
3.9 不同血清浓度对肝细胞生长的影响
在Medium 1和Medium 9中添加血清均能显著增强肝细胞增殖效率。然而，血清在促进肝细胞增殖的同时，也会加速非实质细胞的出现，且浓度越高，促进作用越明显。在Medium 9中，2%的血清浓度能够在显著增强肝细胞增殖的同时，不明显促进非实质细胞的增殖。
3.10 11种培养基中肝细胞的生长特性
基于Medium 5C，对所有培养基的增殖率进行分析发现，Medium 9能显著提高肝细胞增殖率（平均提高46.17%），而Medium 1的促进作用较弱（平均提高23.51%）。在添加2%血清的条件下，Medium 9-a能进一步大幅提升肝细胞增殖效率（平均提高74.94%）。相比之下，血清与无血清序贯培养的策略（如Medium 9-b, 9-c）也能有效提高增殖率，但效果不及持续添加2%血清的Medium 9-a。综上所述，Medium 9或Medium 9-a更适合鸭肝细胞的体外培养。
本研究系统描绘了鸭胚胎肝脏从早期到晚期的发育图谱，揭示了其结构、脂代谢和超微结构的动态变化规律。更重要的是，研究成功攻克了鸭胚肝细胞体外培养的瓶颈。通过严谨的培养基配方设计与筛选，研究人员发现，在包含五种小分子化合物（5C）的基础体系上，额外添加HGF、TNF-α和IL-6细胞因子所配制的Medium 9，以及在Medium 9基础上添加2%血清的Medium 9-a，能够最有效地在长期培养中促进鸭胚肝细胞增殖，同时高效抑制上皮-间质转化（EMT），完美维持肝细胞的典型形态、高纯度（>98%）及关键生理功能（如合成白蛋白和储存肝糖原）。这一优化培养体系的建立，不仅为在细胞和分子水平深入探索鸭特有的肝脏功能（尤其是其卓越的脂质沉积与代谢能力）、营养代谢机制、疾病抵抗及药物毒性评估提供了前所未有的、稳定可靠的体外研究模型和强大工具，也填补了禽类尤其是鸭胚胎肝发育研究与高效原代肝细胞培养技术领域的空白，对相关基础研究与畜牧业应用具有重要价值。
