利用第四代PAMAM树状大分子实现Vismodegib的局部递送：一种治疗卡波西肉瘤的潜在方法

《International Journal of Pharmaceutics》：Topical delivery of Vismodegib using fourth-generation PAMAM dendrimers: a potential treatment for Kaposi’s sarcoma

本研究通过第四代聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子（G4-OH和G4-FA）构建拓扑异构酶抑制剂Vismodegib（VDG）纳米载体，显著提高其水溶性和皮肤渗透性。实验证实G4-OH@VDG纳米复合物在体外抑制角质形成细胞迁移且低毒，并揭示pH依赖的药物释放机制。研究为拓扑异构酶抑制剂局部靶向治疗KS提供了新策略。

大卫·E·伊巴拉（David E. Ybarra）| 路易斯·F·巴拉扎（Luis F. Barraza）| 巴勃罗·尼古拉斯·德弗朗西斯科（Pablo Nicolás De Francesco）| 西尔维娅·德尔瓦莱·阿隆索（Silvia del Valle Alonso）| 乔治·蒙塔纳里（Jorge Montanari）| 费尔南多·C·阿尔维拉（Fernando C. Alvira）

阿根廷布宜诺斯艾利斯贝尔纳尔（邮编1876）的基尔梅斯国立大学（Universidad Nacional de Quilmes），科学技术系，生物纳米技术实验室（Laboratorio de Bio-Nanotecnología，简称LBN）

摘要

本研究旨在开发基于树状大分子的纳米载体，用于局部治疗卡波西肉瘤（Kaposi’s sarcoma，简称KS）。先前的分子对接研究表明，维莫德吉布（Vismodegib，简称VDG）能够抑制环氧化酶-2（Cyclooxygenase-2，简称COX-2），这种酶由病毒致癌蛋白vGPCR转录诱导，并在KS的血管生成表型中起关键作用。在本研究中，VDG与第四代聚（氨基胺）（Poly(amidoamine，简称PAMAM）树状大分子结合，这些树状大分子具有羟基末端基团（G4-OH），并通过叶酸（Folic acid，简称G4-FA）进行表面修饰。由此得到的G4-OH@VDG和G4-FA@VDG复合物显著提高了VDG的水溶性，实验中VDG与树状大分子的比例分别约为4摩尔和8摩尔。G4-OH@VDG的流体力学直径为225.1±122.0纳米（PdI=0.44±0.02），而G4-FA@VDG的直径为210.5±54.7纳米（PdI=0.66±0.08）。FT-IR光谱证实了树状大分子与药物的结合，体外释放研究揭示了不同的、依赖于pH值的释放机制。通过体外（红细胞）和体外（HaCaT角质形成细胞）模型评估了细胞毒性，未观察到细胞毒性效应。使用< />模型进行的皮肤渗透研究表明，这两种系统都能将VDG输送到皮肤中，其中G4-OH@VDG在角质层内的药物积累量更高。在体外KS模型中评估了抗肿瘤活性，发现48小时培养后出现了细胞毒性效应。值得注意的是，G4-OH@VDG表现出最有利的治疗效果，包括在亚致死浓度下显著降低细胞活力和抑制细胞迁移。总体而言，这些结果表明，将药物重新定位与基于树状大分子的纳米技术结合用于局部给药，可以提高VDG在体外Kaposi肉瘤模型中的治疗效果。

引言

血管生成性肿瘤的特点是血管过度生长、内皮细胞高度增殖、炎症过程以及周围组织的重塑。（Carmeliet和Jain，2011；Hanahan，2022；Ramjiawan等人，2017）这些肿瘤通常涉及促进血管生成因子分泌的分子机制、MAPK、AKT和NF-κB等增殖信号通路的激活，以及与炎症和细胞存活相关的酶的上调。（Carmeliet，2005；Jain，2014；Ribatti和Djonov，2012）

卡波西肉瘤（KS）是一种与人类疱疹病毒8型（Human herpesvirus 8，简称KSHV）相关的血管生成性肿瘤。KSHV感染内皮细胞后，会在皮肤和黏膜表面引发红斑丘疹，并导致病毒G蛋白偶联受体（vGPCR）的持续过表达，vGPCR是一种关键的病毒致癌蛋白。vGPCR激活多种细胞内信号通路，进而上调环氧化酶-2（COX-2），该酶参与炎症和前列腺素（PGE2）的产生，从而促进KS的血管生成和肿瘤形成。（Mesri等人，2010）例如，研究表明vGPCR通过MAPK信号通路刺激COX-2的表达，从而促成该疾病的特征性血管生成表型。（Medina等人，2020）目前全球KS的发病率约为每10万人每年0.39例，2020年新增病例约34,270例，死亡病例15,086例，年龄标准化死亡率为约0.18/10万人。（Sung等人，2021）撒哈拉以南非洲地区的病例和死亡人数最多，这主要是由于HIV共感染和有效抗逆转录病毒治疗的有限可及性。KS的现有治疗方法包括观察、手术或放疗（针对小范围或局部病变）。对于HIV相关的病例，高效抗逆转录病毒治疗是管理的重要组成部分。对于更晚期的疾病，则使用全身化疗和局部或局部治疗药物。然而，许多这些治疗方法具有侵入性、成本高昂，并伴有显著的不良反应。此外，现有的局部治疗药物（如基于维甲酸的凝胶）在所有病例中并未显示出一致的治疗效果。这些局限性凸显了迫切需要开发新的治疗策略，这些策略应更安全、更易获取、侵入性更低，并提供更好的效益-风险比。（Schneider和Dittmer，2017）

在这种情况下，药物重新定位成为一种有前景的策略，因为它可以利用已经获得其他适应症批准的化合物来减少临床开发的成本和时间（Ashburn和Thor，2004；Pushpakom等人，2019）。Yasir等人进行了分子对接分析，以识别具有潜在抑制环氧化酶-2（COX-2）活性的FDA批准药物。在这些药物中，维莫德吉布（VDG）排名前15位，其结合能值非常低，表明与活性位点内的氨基酸残基有强相互作用。具体来说，配体-蛋白质对接分析显示VDG与Arg120和Leu352残基形成了三个氢键。除了计算机模拟结果外，该研究还在RBL-2H3细胞中进行了实验验证，VDG的COX-2抑制活性显著高于选择性COX-2抑制剂塞来昔布（celecoxib）。然而，据我们所知，VDG在Kaposi肉瘤模型中的抑制潜力尚未得到研究。（Yasir等人，2023）

维莫德吉布是一种选择性抑制剂，作用于Hedgehog信号通路中的Smoothened蛋白。该药物于2012年被批准作为基底细胞癌的一线治疗药物。然而，由于其分子结构，VDG的生物分布较差，全身给药会带来不良副作用。（Rimkus等人，2016；Sekulic等人，2012）尽管如此，药物纳米技术可能为克服这些挑战提供有希望的解决方案。事实上，最近的研究强调了纳米药物作为Kaposi肉瘤抗肿瘤疗法的潜力。（Gugleva等人，2025；Principe等人，2023）在这项工作中，我们提出了使用第四代聚（氨基胺）（PAMAM）树状大分子，其明确的结构为可控的药物递送提供了多功能平台，并且之前已证明能够穿透人体皮肤。（Ybarra等人，2022）PAMAM树状大分子，也称为级联大分子，是由乙二胺核心组成的化学合成纳米结构，从中衍生出分支和重复的聚（氨基胺）单元。在末端，可以是伯胺、羟基或羧基，在生理pH值下赋予阳离子、中性或阴离子表面电荷。然而，传统的具有阳离子胺末端的PAMAM树状大分子通常具有细胞毒性，因为它们与细胞膜有强烈的静电相互作用。（Boas等人，2004；Janaszewska等人，2019）为了提高其生物相容性，我们建议使用具有羟基末端基团（G4-OH）的第四代PAMAM树状大分子。最近的研究表明，羟基化树状大分子纳米凝胶能够将药物和免疫调节细胞因子共同递送到肿瘤模型中，实现协同治疗效果。（Wang等人，2025）另一方面，使用从G4氨基末端基团（G4-NH₂）进行表面修饰的PAMAM树状大分子作为活性靶向配体，利用了血管生成性肿瘤组织中叶酸受体的过表达。（Pillay等人，2020；Tarach等人，2021）

因此，本研究的目的是开发并表征负载VDG的PAMAM树状大分子纳米复合物，这是一种结合药物重新定位和基于纳米技术的双重方法，以优化VDG的局部递送，同时最小化细胞毒性和全身不良反应。

材料

购买了具有乙二胺核心的第四代聚（氨基胺）（PAMAM）树状大分子，其末端含有64个伯胺基团（G4-NH₂，分子量Mw=14,214 g/mol）和64个羟基（G4-OH，分子量Mw=14,277 g/mol），分别来自Sigma-Aldrich（智利和阿根廷分公司）。叶酸（FA）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺HCl（EDC）和三乙胺均来自Sigma Aldrich?（智利分公司）。维莫德吉布（VDG）购自Molport（拉脱维亚）。磷酸盐

叶酸修饰树状大分子的合成与验证

从表面含有64个伯胺基团（G4-NH₂）的第四代树状大分子开始，通过叶酸（FA）进行表面修饰，得到叶酸修饰的树状大分子（G4-FA）。通过¹H NMR光谱确认了PAMAM树状大分子成功修饰为叶酸（FA）（补充材料1B）。光谱显示了2.2至3.8 ppm之间的特征PAMAM信号，以及三个低场信号（6.2–8.4 ppm）

结论

本研究旨在通过重新定位药物维莫德吉布（VDG）并将其纳入纳米载体系统来增强其疗效，从而为Kaposi肉瘤的新治疗策略做出贡献。成功获得了超分子复合物，使用商业化的和经酸修饰的第四代PAMAM树状大分子作为VDG载体，并对其物理化学性质、药物释放和皮肤渗透特性进行了全面表征。

未引用的参考文献

Raszewska-Famielec和Flieger（2022年12月15日）

CRediT作者贡献声明

大卫·E·伊巴拉（David E. Ybarra）：撰写初稿、正式分析、数据管理。 路易斯·F·巴拉扎（Luis F. Barraza）：监督、方法学设计、正式分析、数据管理。 巴勃罗·尼古拉斯·德弗朗西斯科（Pablo Nicolás De Francesco）：正式分析、数据管理、概念构思。 西尔维娅·德尔瓦莱·阿隆索（Silvia del Valle Alonso）：方法学设计、正式分析、数据管理、概念构思。 乔治·蒙塔纳里（Jorge Montanari）：撰写初稿、验证、监督、研究、正式分析、概念构思。 费尔南多·C·阿尔维拉（Fernando C. Alvira）：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

D.E. Ybarra衷心感谢阿根廷国家科学技术研究委员会（CONICET）在战略领域计划（2020–2025）下提供的博士奖学金。P.N. De Francesco、S.d.V. Alonso、J. Montanari和F.C. Alvira是CONICET的科研人员。本研究得到了PUNQ项目（合同编号1607/25）的支持。

作者感谢Prieto Maria Jimena教授和Martinez Carolina Soledad教授的宝贵讨论。