《Journal of Advanced Research》：Omics insights into MYBL2-promoted cancer stem-like cells driving ferroptosis resistance in hepatocellular carcinoma
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为了解决肝细胞癌（HCC）中癌症干细胞（CSC）介导肿瘤发生和铁死亡抵抗的机制不清问题，研究者利用单细胞转录组学、分子生物学及临床数据分析，鉴定出MYBL2驱动的癌症干细胞样细胞（CSLC）是肝癌进展的关键。研究发现，该亚群通过增强GPX4为中心的谷胱甘肽代谢抑制脂质过氧化，抵抗铁死亡，并与活化的肝星状细胞协同构建促癌微环境。基于此构建的CSLC.Sig六基因模型具有优异预后预测能力，为靶向CSC的肝癌治疗提供了新策略。
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是一种侵袭性高、预后差的恶性肿瘤。尽管治疗手段不断进步，但肿瘤的复发、转移和治疗抵抗仍是临床面临的巨大挑战。越来越多的证据表明，肿瘤内部并非“铁板一块”，其中存在着一小撮具有特殊能力的“种子”细胞——癌症干细胞（Cancer Stem Cells, CSCs）。这类细胞拥有强大的自我更新能力和分化潜能，被认为是驱动肿瘤生长、异质性、治疗抵抗和复发的“罪魁祸首”。然而，肝细胞癌中的CSCs群体本身也具有高度的异质性，且缺乏稳定可靠的标志物，这使得精确识别和靶向它们变得异常困难。更令人费解的是，尽管肿瘤微环境中充满压力，这些“种子”细胞却能顽强存活，它们究竟有何“生存秘诀”？近年来，一种新型的细胞死亡方式——铁死亡（ferroptosis）——进入了研究者的视野。它依赖于铁离子和脂质过氧化的积累，而许多肿瘤细胞，包括CSCs，似乎演化出了抵抗铁死亡的能力，这可能正是它们得以存续的关键。那么，在肝细胞癌中，是否存在特定的CSC亚群？它们如何抵抗铁死亡？其背后的核心调控机制又是什么？这些问题亟待解答。
为了解决这些难题，来自南方医科大学等机构的研究团队在《Journal of Advanced Research》上发表了一项综合性研究。他们巧妙地利用了c-Myc诱导的转基因小鼠肝癌模型和来自患者的单细胞转录组学数据，结合多种生物信息学分析和分子生物学实验，深入探究了肝癌中癌症干细胞样细胞的特性及其抵抗铁死亡的分子机制。
为开展这项研究，作者主要运用了几个关键技术方法：首先，他们建立了c-Myc/CreAlb转基因小鼠肝癌模型，并利用单核RNA测序（snRNA-seq）和来自患者的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（GSE149614和GSE166635数据集）绘制了肝癌的单细胞转录组图谱。其次，他们通过inferCNV、CopyKAT等算法推断细胞拷贝数变异，结合细胞周期、分化潜能和干性指数计算，识别出了具有高增殖、低分化特征的癌症干细胞样细胞（Cancer stem-like cells, CSLCs）亚群。再者，研究者运用伪时间轨迹分析、转录因子调控网络分析（pySCENIC）和细胞间通讯分析（CellChat）等生物信息学工具，探索了CSLCs的动态变化、关键调控因子及其与微环境的相互作用。此外，研究还整合了TCGA-LIHC、GSE43619等公共数据库的批量RNA测序数据用于预后分析，并利用空间转录学数据和细胞2定位（cell2location）算法分析了CSLCs的空间分布。最后，在体外实验中，他们通过siRNA敲低、肿瘤球形成实验、细胞活力测定、谷胱甘肽（GSH）检测、脂质过氧化检测（C11-BODIPY 581/591染色）和透射电镜等技术，在Huh-7和SNU387细胞系中验证了关键基因MYBL2和GPX4的功能。
研究结果
1. 单核转录组图谱揭示c-Myc驱动的肝癌小鼠模型细胞组成
研究者首先对c-Myc/CreAlb转基因小鼠的肝癌组织和正常肝组织进行了snRNA-seq分析，获得了50,944个高质量单细胞。通过无监督聚类和经典标志基因鉴定，将这些细胞注释为肝实质细胞、肝星状细胞、胆管细胞、内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞和中性粒细胞等9种主要细胞类型。与正常组织相比，肝癌组织中c-Myc表达显著上调，且肝实质细胞比例（60%-80%）更接近肝脏真实细胞组成，证明了snRNA-seq在捕获实质细胞方面的优势。
2. 鉴定出具有显著干性特征且预后不良的CSLCs
进一步对39,089个肝实质细胞进行亚群分析，发现了9个亚群。通过拷贝数变异分析和细胞周期评估，研究者鉴定出Hep-6至Hep-8这三个主要存在于肿瘤组织、具有高增殖活性和高分化潜能的亚群，并将其定义为癌症干细胞样细胞（CSLCs）。CSLCs表现出显著高于其他肝细胞亚群的干性指数，且高表达增殖标志物（如Mki67），但并未特异性高表达传统的CSC标志物（如Cd44、Cd133），提示其是一类转录上不同于经典CSCs的新型亚群。功能状态分析显示，CSLCs与细胞周期、干性、上皮-间质转化（EMT）、转移等促癌功能正相关。重要的是，基于CSLCs特征基因集的预后分析表明，无论是在TCGA-LIHC队列还是GSE43619数据集中，CSLCs特征高的患者总生存期都显著更差，证明了其与不良预后的强相关性。
3. 患者与小鼠来源的CSLCs具有跨物种保守性
分析HCC患者的scRNA-seq数据（GSE149614），研究者同样鉴定出了具有高CNV评分、高增殖、低分化特征的CSLCs亚群（亚群19-21）。该亚群在患者原发瘤、门静脉癌栓和转移淋巴结中的比例逐渐增加，干性指数也随之升高。跨物种保守性分析（CACIMAR）显示，患者来源的CSLCs与小鼠来源的CSLCs具有高度相似性，证实了该亚群在物种间的保守性及其在肝癌进展中的普适性。
4. CSLCs通过抑制脂质氧化促进铁死亡抵抗
伪时间轨迹分析显示，CSLCs从肝癌发生早期就出现并持续存在，且干性相关基因表达逐渐上调。沿着伪时间轨迹，谷胱甘肽代谢、抗氧化等通路被激活，而脂质氧化通路被抑制。基因集富集分析进一步证实，无论是小鼠还是患者来源的CSLCs，都特异性富集了干性相关通路，并显著抑制了脂质氧化相关通路。此外，CSLCs高表达关键的铁死亡抑制因子GPX4。这些结果表明，CSLCs通过激活以GPX4为中心的谷胱甘肽代谢来抑制脂质过氧化，从而获得内在的铁死亡抵抗能力，以在肿瘤微环境中存活。
5. MYBL2是维持干性和铁死亡抵抗的关键调控因子
转录因子活性分析（pySCENIC）发现，转录因子MYB原癌基因样蛋白2（MYB Proto-Oncogene Like 2, MYBL2）在CSLCs中特异性激活，且MYBL2高表达的细胞干性指数更高。功能实验证实，肿瘤球中MYBL2表达上调，敲低MYBL2可显著损害Huh-7和SNU387细胞的肿瘤球形成能力，表明MYBL2对维持癌症干性至关重要。在铁死亡方面，敲低MYBL2使肝癌细胞对铁死亡诱导剂RSL3更敏感，表现为细胞活力下降、克隆形成减少、谷胱甘肽（GSH）水平降低、脂质过氧化水平升高以及典型的铁死亡线粒体形态改变（如线粒体皱缩、嵴减少），而铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）可逆转这些效应。此外，MYBL2敲低还增强了肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。
6. GPX4受MYBL2上调并挽救MYBL2敲低导致的铁死亡易感性
单细胞数据显示，MYBL2高表达的细胞中GPX4表达也更高。体外实验证明，敲低MYBL2降低了GPX4的mRNA和蛋白水平。虽然敲低GPX4不影响肿瘤球形成，但过表达GPX4可以有效挽救由MYBL2敲低导致的细胞活力下降和脂质过氧化增加。这表明GPX4是MYBL2下游介导铁死亡抵抗的关键效应因子，但不直接参与干性维持。
7. 构建用于预测HCC预后的六基因CSLC.Sig模型
通过交集分析MYBL2靶基因和CSLCs中上调基因，研究者确定了MYBL2、EZH2、RACGAP1、ATAD2、TOP2A和CDCA2这六个基因，并以此构建了CSLC.Sig预后风险模型。该模型在TCGA-LIHC内部验证集和外部验证集（GSE43619和GSE14520）中均表现出优异的预后预测性能，高风险组患者总生存期显著更短。多因素Cox回归分析证实CSLC.Sig是一个独立的预后因素。
8. 活化的肝星状细胞与CSLCs在微环境中存在强相互作用
细胞通讯分析揭示，CSLCs与肝星状细胞（HSCs），特别是活化的HSCs（aHSCs）之间存在强烈的相互作用，涉及Col1a1、Col1a2、Cdh2等与纤维化相关的信号通路。空间转录组学分析显示，CSLCs与aHSCs在空间上呈“邻居”式共定位。多重免疫组化也证实了MYBL2阳性的CSLCs与α-SMA阳性的aHSCs在空间上邻近，且其相互作用界面富含CDH2表达。这些发现表明，aHSCs与CSLCs之间的紧密互作共同塑造了一个协同的促肿瘤微环境。
研究结论与意义
本研究通过整合多组学数据，系统性地鉴定出肝癌中一个由MYBL2驱动的、具有高干性特征的癌症干细胞样细胞（CSLCs）亚群。该亚群不依赖于传统的CSC标志物，但与肿瘤转移和患者不良预后密切相关。机制上，CSLCs通过MYBL2上调GPX4，增强谷胱甘肽代谢，从而有效抑制脂质过氧化，获得强大的铁死亡抵抗能力，这是其在恶劣肿瘤微环境中得以存活的关键。此外，CSLCs与活化的肝星状细胞在空间和功能上紧密互作，共同构建了支持肿瘤进展的生态位。基于此，研究构建的以MYBL2为核心的六基因CSLC.Sig预后模型，展现出了优异的临床预测潜力。
这项研究的意义重大。首先，它深化了对肝癌干细胞异质性的理解，揭示了一类新型的、具有明确分子特征和功能的CSC亚群。其次，它阐明了MYBL2在同时调控癌症干性和铁死亡抵抗中的核心作用，为开发同时针对这两个脆弱点的联合治疗策略提供了新的靶点。例如，靶向MYBL2或可同时削弱肿瘤的“种子”细胞及其“盔甲”（铁死亡抵抗），并增强其对索拉非尼等药物的敏感性。最后，研究所构建的预后模型和揭示的CSLCs-aHSCs互作轴，为肝癌的精准预后评估和微环境靶向治疗提供了新的思路和工具。尽管未来仍需在体内模型和更大临床队列中进一步验证，但本研究无疑为攻克肝癌的复发转移难题带来了新的希望。
