《Bioengineering & Translational Medicine》：Self-assembled verteporfin nanoparticles decrease drug efflux by P-glycoprotein without light activation in drug-resistant cancer cells
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本研究聚焦于P-糖蛋白(P-gp)介导的肿瘤多药耐药(MDR)这一临床化疗的主要障碍。研究人员探索了FDA批准的光敏剂维替泊芬(VP)在无光激活条件下，以自组装纳米颗粒(NanoVP)的形式，通过靶向线粒体代谢、降低ATP产生，从而持续抑制P-gp外排功能的新应用。结果表明，5 μM NanoVP处理72小时可显著降低耐药细胞的线粒体ATP水平，增加P-gp底物在细胞内的蓄积，并增强化疗药物在耐药细胞中的疗效。这项研究为克服P-gp介导的MDR、提高化疗疗效提供了一种新颖的、不依赖于光照的代谢“启动”策略，拓宽了VP的治疗应用范围。
在癌症治疗的战场上，化疗药物常常遭遇“出师未捷身先死”的尴尬。一种名为P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)的“分子泵”在癌细胞表面过度表达，能将化疗药物主动泵出细胞，使其无法发挥作用，这种现象被称为多药耐药(Multidrug Resistance, MDR)。多年来，科学家们试图用小分子抑制剂“堵住”这个泵，但往往因剂量过高、毒性太大而收效甚微。那么，有没有更巧妙的方法，能让这个“泵”自己罢工呢？
一种名为维替泊芬(Verteporfin, VP)的药物进入了研究者的视野。它本是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的光敏剂，用于光动力疗法(Photodynamic Therapy, PDT)治疗眼部疾病。有趣的是，先前研究发现，在光照激活下，VP不仅能直接作用于P-gp蛋白，还能造成线粒体损伤，导致ATP（细胞的“能量货币”）耗竭，从而削弱P-gp的“泵”功能。然而，光照的依赖性和抑制效果的可逆性，限制了其应用。一个大胆的想法由此产生：如果不依赖光照，VP能否同样通过“断供能量”的方式，让过度劳累的P-gp“泵”瘫痪，从而逆转耐药性？这正是发表在《Bioengineering & Translational Medicine》上的这项研究试图回答的核心问题。
为了验证这一假说，研究人员开展了一项系统性的体外研究。他们采用了来自三阴性乳腺癌和卵巢癌的两对细胞模型，每一对都包括对药物敏感的亲本细胞系和通过药物筛选获得的、P-gp过表达的耐药细胞系。研究首先制备了VP的自组装纳米聚集体(NanoVP)，以改善其递送。核心技术手段包括：使用安捷伦Seahorse细胞能量代谢分析系统实时监测细胞的耗氧率(OCR)、细胞外酸化率(ECAR)以及线粒体与糖酵解来源的ATP生成速率，以此评估NanoVP对细胞能量代谢的影响；通过CellTiter-Fluor细胞活力检测试剂盒测定NanoVP及联合化疗药物处理后的细胞活性；利用流式细胞术，通过荧光底物（罗丹明123和钙黄绿素-AM）的细胞内蓄积来定量评估P-gp的外排功能，并使用P-gp构象特异性抗体UIC2检测P-gp的构象或表达变化；最后，通过VP提取实验量化细胞内药物蓄积水平。
2.1 NanoVP在不依赖光照的条件下降低耗氧率、细胞外酸化率以及线粒体和糖酵解ATP生成速率
研究人员发现，随着NanoVP浓度增加，无论是对药物敏感的MDA-MB-231细胞还是耐药的VBL-MDA-MB-231细胞，其基础耗氧率(OCR)均进行性下降。细胞对电子传递链抑制剂寡霉素的响应能力丧失，表明氧化磷酸化(OXPHOS)在电子传递链被抑制前就已受到整体抑制。线粒体ATP生成速率在低至2.5 μM的NanoVP浓度下就显著降低，而糖酵解ATP生成速率也在较高浓度下受到中等程度的抑制。这些结果证实，无光激活的NanoVP暴露可抑制线粒体呼吸，且耐药细胞在能量代谢上表现出更强的可塑性。
2.2 NanoVP降低耐药细胞的活力
通过测定不同时间点（24、48、72小时）NanoVP处理后的细胞活力，研究人员发现耐药细胞对NanoVP更为敏感，其半数抑制浓度(IC50)值低于对应的亲本细胞。重要的是，他们确定了5 μM NanoVP处理72小时这一条件，能在对细胞毒性最小的情况下，最大程度地降低ATP生成耦合呼吸水平（在耐药细胞中降低超过80%），从而为后续研究P-gp功能创造了理想的代谢扰动状态。
2.3 三阴性乳腺癌和卵巢癌细胞系中细胞内NanoVP蓄积在72小时内无显著差异
细胞内VP蓄积实验显示，在5 μM浓度下处理72小时，耐药细胞与亲本细胞的VP蓄积量没有统计学差异，表明不同细胞系对NanoVP的敏感性差异并非主要由摄取差异造成。而在2 μM浓度下处理72小时，耐药细胞中VP蓄积显著低于亲本细胞，说明P-gp仍具有外排功能。这揭示了一个浓度依赖的阈值效应：持续暴露于5 μM NanoVP会导致P-gp功能抑制。
2.4 NanoVP在72小时后增加耐药细胞中细胞内底物蓄积
流式细胞术分析表明，经5 μM NanoVP处理72小时后，两种耐药细胞系中P-gp的两种荧光底物——罗丹明123和钙黄绿素的细胞内蓄积均显著增加（钙黄绿素增加5-7倍），而在亲本细胞中变化不大。这直接证明了在选定的处理条件下，P-gp介导的底物外排功能受到了有效抑制。
2.5 72小时NanoVP长期处理影响UIC2与P-gp的结合
通过检测P-gp构象特异性抗体UIC2的结合情况，研究人员发现，在两种耐药细胞中，经NanoVP处理后，若未用环孢素A(CsA)预处理，UIC2结合增加；若用CsA预处理（可稳定P-gp的向内开放构象），则UIC2结合反而减少。这表明长期的NanoVP暴露可能改变了P-gp的构象和/或占据了其底物结合口袋，影响了CsA对其构象的稳定作用，从转运蛋白水平提示了P-gp功能受到调制。
2.6 联合NanoVP治疗改善耐药细胞的化疗反应
最关键的功能验证显示，5 μM NanoVP与化疗药物（长春花碱、阿霉素或伊立替康）联合处理72小时，能显著降低这些P-gp底物类药物在耐药细胞中的IC50值，即增强了化疗疗效。例如，在耐药的VBL-MDA-MB-231细胞中，长春花碱的IC50从143.1 nM降至24.98 nM。而在亲本细胞中，联合治疗并未表现出类似的增敏效果，有时甚至降低了细胞对化疗的敏感性。这凸显了NanoVP的化疗增敏作用具有选择性，特异性地针对依赖P-gp过表达的耐药肿瘤细胞。
2.7 局限性与未来方向
研究也指出了自身的局限性，如未直接探究Hippo通路（YAP-TEAD信号）的作用，代谢测定未明确分子靶点，以及所有实验均在体外进行等。未来需要在体内模型中评估NanoVP的药代动力学和疗效，并探索优化的给药方案。
本研究得出结论，在不依赖光照的条件下，对肿瘤细胞进行长时间（72小时）的、适当浓度（5 μM）的自组装维替泊芬纳米颗粒(NanoVP)暴露，能够通过靶向线粒体代谢、显著降低ATP水平，从而有效抑制P-糖蛋白的外排功能。这种抑制体现在细胞内P-gp底物蓄积的增加、P-gp构象或相互作用的改变，并最终转化为对多种P-gp底物类化疗药物疗效的显著增强。这项工作首次系统地证实了VP在无光激活情况下，作为一种“代谢启动”剂，通过利用P-gp过表达细胞固有的代谢脆弱性来克服多药耐药的新颖策略。它不仅拓宽了这种已获批药物的临床应用范围，绕过对光照设备的依赖，也为开发针对耐药肿瘤的下一代代谢联合疗法奠定了重要的基础。尽管仍需进一步的体内研究和临床转化，但这项研究无疑为应对癌症治疗中顽固的多药耐药挑战，提供了一条充满希望的新路径。
