人类羊膜的脱细胞处理及其对网状生物支架性能的影响

《Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials》：Decellularization of human amniotic membrane and its impact on mesh bioscaffold properties

本研究对比了两种脱细胞化方法（EDTA辅助胰蛋白酶处理和可逆碱膨胀结合非离子去污剂）对人类羊膜膜（hAM）的影响，评估了脱细胞后ECM成分、力学性能及上皮细胞再生的效果。结果表明，胰蛋白酶处理显著降低纤维连接蛋白水平并影响弹性性能，而碱膨胀法保留更多sGAG和更好的力学特性，表面特征影响细胞附着。该方法学为hAM生物支架开发提供依据。

　　

里卡多·A·阿尔坎塔拉-莫雷诺（Ricardo A. Alcántara-Moreno）| 瓜达卢佩·H·卢埃瓦诺-科尔梅内罗（Guadalupe H. Luévano-Colmenero）| P.A.I. 埃尔南德斯（P.A.I. Hernandez）| 埃斯特拉·P·加西亚-特哈达（Esthela P. García-Tejada）| 西尔维娅·迪亚兹-桑多瓦尔（Silvia Díaz-Sandoval）| P. 纳耶利·阿尔瓦-穆里略（P. Nayeli Alva-Murillo）| 伊莎贝尔·德尔加迪略-霍尔特福特（Isabel Delgadillo-Holtfort）| J. 毛里西奥·弗洛雷斯-莫雷诺（J. Mauricio Flores-Moreno）| 比尔扎比思·门多萨-诺维洛（Birzabith Mendoza-Novelo）

瓜纳华托大学科学与工程学院，墨西哥莱昂州Loma del Bosque 103，邮编37150

摘要

人类羊膜（hAM）是一种富含胶原蛋白的组织，在组织工程中越来越多地被用作天然支架。这些应用中的一个关键步骤是去细胞化，即提取细胞外基质（ECM）作为生物材料。在本研究中，使用两种不同的方法处理了原始羊膜：一种是用EDTA辅助的胰蛋白酶进行肽键水解（En方法）；另一种是使用非离子表面活性剂结合可逆碱性膨胀（SD方法），同时进行细胞膜破坏处理，并利用核酸酶活性。评估了每种方法对处理后羊膜的组成、结构和拉伸性能的影响。此外，还评估了上皮细胞在去细胞化羊膜两个表面的重新接种效率。比较去细胞化羊膜和消化后的羊膜与原始组织发现，En方法的残留DNA含量在0.14%到30%之间，SD方法的残留DNA含量在1.7%到10%之间。同时，硫酸化糖胺聚糖（sGAG）的含量分别为1.5%到30%和1%到18%。En方法显著降低了纤维连接蛋白的水平，而SD方法则减少了去细胞化羊膜中露出的成分中的lumican蛋白。经过En处理的样本表现出改变的弹性和断裂特性，这对它们的机械性能产生了负面影响。源自羊膜的ECM材料被人类阴道上皮细胞重新接种，其形态取决于原始组织解剖部分的表面特性。总体而言，这些结果表明，原始组织的变异性影响了源自羊膜材料的最终组成，拉伸性能受所用去细胞化方法的影响，表面特性在上皮细胞重新接种中起着关键作用。

引言

人类羊膜（hAM）由三层组成：一层上皮细胞、一层基底膜和一层基质层，基质层包括致密的成纤维细胞和海绵状细胞。hAM是一种富含胶原蛋白的组织，半透明，厚度范围为0.07至0.3毫米（Gholipourmalekabadi等人，2015a；Jabareen等人，2009；Shilo和Shalev，2023），这与绒毛膜羊膜不同，后者的厚度范围为0.2至0.6毫米（Milan等人，2020a；Shilo和Shalev，2023）。hAM在广泛的临床应用中得到越来越多的使用，包括眼科移植（Mamede等人，2012；Riau等人，2010）和组织工程产品（Arrizabalaga和Nollert，2018；Hu等人，2023；van Hengel等人，2025）。无论是脱水还是冷冻保存，基于hAM的产品都获得了监管机构的批准，并被用于重建泌尿学、皮肤和肌腱再生以及血管移植制造等应用。这些应用得到了hAM调节胶原蛋白生产和沉积能力的支持（Guo等人，2024；Munoz-Torres等人，2023a，2023b）。尽管在研究其生物学特性方面取得了显著进展，但由于异体或异种移植后的免疫原性和排斥反应，仍存在一些问题（Hu等人，2023；van Hengel等人，2025）。为了克服这些限制，一种有前景的策略是使用不同的方法对hAM进行去细胞化处理。然后，可以将其作为生物支架使用，其中细胞外基质（ECM）作为结构支持、细胞附着位点以及诱导组织重塑的信号分子库。

绒毛膜羊膜的拉伸强度主要由羊膜本身决定（Niknejad等人，2008；Oxlund’等人，1990；Shilo和Shalev，2023），其失效特性可以是各向同性的或各向异性的，这取决于羊膜是来自胎盘（近端）还是周围（远端）（Grémare等人，2019）。存在于羊膜基质层中的ECM成分组织成ECM蛋白束，并散布着弹性纤维（Salah等人，2018）。胶原纤维排列的各向异性程度与粘弹性特性的差异有关，包括硬度（Chen等人，2012）。此外，嵌入非晶基质中的弹性纤维定义了这种软组织材料的非线性机械行为（Jabareen等人，2009；Koh等人，2019；Mendoza-Novelo等人，2011）。

用于从hAM组织中去除细胞的有效方法也会改变ECM成分的组成，从而导致与未处理组织相比不同的机械响应和细胞适应性。例如，基底膜中的IV型胶原在血管系统中提供生物活性信号，而纤维连接蛋白在细胞粘附、迁移和分化中起重要作用（Arenas-Herrera等人，2013）。基于机械技术的程序（如刮除）会导致基底膜的破坏，而基于酶的程序（如dispase和胰蛋白酶）则会损害胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白（Khosravimelal等人，2020；Milan等人，2020b）。氢氧化钠处理被用来诱导hAM组织膨胀，从而促进去细胞化（Cui等人，2020），并且通常与机械刮除结合使用，尽管存在上述不利影响（Gholipourmalekabadi等人，2015b；Milan等人，2020b）。碱性处理可诱导组织膨胀，有助于打开纤维间和细胞间隙，从而增加生物支架的孔隙率和表面积（Mendoza-Novelo等人，2011）。当这种膨胀是可逆的时，可以在不改变原始组织三维结构的情况下获得有利的结果。

本研究旨在比较两种方法，即胰蛋白酶处理和可逆碱性膨胀，以实现hAM组织的有效去细胞化，评估不同处理方法之间的差异，并评估它们对所得生物支架的结构和拉伸性能的影响。此外，还研究了阴道上皮细胞在这些材料上的接种反应，作为开发工程化阴道组织的第一步。原始组织被用作对照材料进行比较。因此，这项工作建立了去细胞化程序、残留ECM组成以及源自hAM的组织网产品的粘弹性特性之间的关系。

组织制备

从首次怀孕的捐赠者分娩后立即获取了十二个羊膜囊，用蒸馏水冲洗以去除血液和体液，并进行解剖以去除胎盘部分。墨西哥莱昂州的巴希奥再生医学实验室有限公司（Laboratorio Especializado de Medicina Regenerativa del Bajío S.A.）根据以下标准获取了组织样本：首次怀孕的女性，年龄在30岁以下，无并发症，通过剖宫产分娩，并已获得知情同意。

hAM组织的去细胞化

来自六个不同捐赠者的组织样本在酶处理（图1a）和膨胀/表面活性剂处理（图1b）后的DNA含量低于原始组织。通过En方法或SD方法处理的hAM基质中的残留DNA含量分别为186 ± 71（9-1015）ng/mg和220 ± 35（31-508）ng/mg，这意味着每毫克原始hAM中有1.5至11.5微克的DNA残留，分别占0.14-30%或1.7-10%。这些观察结果基于...

讨论

探讨了hAM组织的去细胞化过程，因为剩余的ECM材料可能适合作为组织工程中的生物支架。对原始hAM组织应用了两种去细胞化方法，以评估细胞和核物质的去除效率及其对ECM大分子含量、拉伸粘弹性特性和上皮细胞重新接种的影响。这意味着研究了两种作用于原始hAM的机制...

结论

本研究的结果表明，使用非离子表面活性剂和可逆碱性膨胀（SD）处理人类羊膜组织是一种有效的方法，可以在保留原始组织的超微结构、机械各向异性和拉伸阻力的同时减少细胞物质。与EDTA/胰蛋白酶（En）处理相比，推荐使用SD方法进行组织去细胞化，因为水解反应会导致弹性和断裂特性的改变。

作者贡献声明

里卡多·A·阿尔坎塔拉-莫雷诺（Ricardo A. Alcántara-Moreno）：撰写——初稿、方法学、研究、数据管理、概念化。 瓜达卢佩·H·卢埃瓦诺-科尔梅内罗（Guadalupe H. Luévano-Colmenero）：撰写——初稿、验证、研究、概念化。 P.A.I. 埃尔南德斯（P.A.I. Hernandez）：撰写——初稿、验证、方法学。 埃斯特拉·P·加西亚-特哈达（Esthela P. García-Tejada）：验证、方法学。 西尔维娅·迪亚兹-桑多瓦尔（Silvia Díaz-Sandoval）：验证、资源管理。 P. 纳耶利·阿尔瓦-穆里略（P. Nayeli Alva-Murillo）：撰写——审稿与编辑、验证。 伊莎贝尔·德尔加迪略-霍尔特福特（Isabel Delgadillo-Holtfort）：撰写——审稿...

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：比尔扎比思·门多萨-诺维洛（Birzabith Mendoza-Novelo）报告称获得了科学、人文、技术和创新秘书处的财务支持。P. 纳耶利·阿尔瓦-穆里略（P. Nayeli Alva-Murillo）报告称获得了科学、人文、技术和创新秘书处的财务支持。比尔扎比思·门多萨-诺维洛（Birzabith Mendoza-Novelo）还报告获得了创新科学研究所的财务支持...

致谢

本研究部分由CF-2023-I-2285 SECIHTI、CF-2019-2000065 SECIHTI和053/2021 IDEAGTO资助，并得到了RAAM、GHLC和PAIHB奖学金的支持。我们感谢Gloria L. Barrera和Abraham Asahel Gasca Venegas（瓜纳华托大学生物系显微镜部门）在去细胞化阶段提供的技术支持，以及他们在活细胞/死细胞显微镜成像方面的帮助。