《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Inhibitory potential of
Morus alba Leaf extract and its phytoconstituent against SARS-CoV-2 main protease: An integrative
in silico and
in vitro analysis
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白桑叶提取物通过体外CHO细胞模型显示显著抑制SARS-CoV-2 3CLpro酶活性，mRNA抑制率达99%（IC50=105±5μg/mL），蛋白抑制率80%。计算筛选发现naringin等三种黄酮类化合物具有强结合亲和力，其中naringin在分子动力学模拟中形成最稳定复合物（-63.03 kcal/mol）。研究为开发新型抗病毒药物提供候选化合物依据。
Ayesha Malik | Sobia Noreen | Bushra Ijaz
旁遮普大学分子生物学卓越中心，巴基斯坦拉合尔Thokar Niaz Baig，West Canal Road 87号，邮编53700
摘要
SARS-CoV-2的3CLpro蛋白对病毒复制至关重要，因此被认为是一个有前景的药物靶点。在这项研究中，3CLpro基因被克隆并在CHO细胞中短暂表达，以建立一个功能性的体外药物筛选模型。评估了Morus alba （桑树）叶提取物的抑制潜力。MTT实验显示，在3.12至100 μg/mL的浓度范围内，该提取物对CHO细胞无毒。qPCR和Western blot分析显示，在mRNA水平上3CLpro基因显著下调，抑制率可达99%（IC50 = 105 ± 5 μg/mL）；在100 μg/mL的剂量下，蛋白质水平的抑制率可达80%。通过计算筛选了29种Morus alba 叶化合物，以确定潜在的3CLpro抑制剂。结果表明，naringin、nicotiflorin和cyclomorusin的结合亲和力分别为-9.8至-9.6 kcal/mol，而参考药物nirmatrelvir的结合亲和力为-9.0 kcal/mol。MM-GBSA和分子动力学模拟分析进一步证实naringin是相对稳定的复合物，其结合自由能最低（-63.03 kcal/mol）。总之，这些发现表明MA提取物显著下调了CHO细胞中主要蛋白酶的短暂表达，计算分析表明naringin是一个潜在的别构抑制剂。然而，需要进一步的研究来确认其直接的酶抑制活性以及病毒感染效应，以便未来进行药物开发。
引言
严重急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）最初在中国武汉被发现，是导致COVID-19的病原体，并于2019年12月演变成全球性大流行
(1) 。截至2026年2月，世界卫生组织（WHO）记录的COVID-19病例超过7.79亿例，死亡人数约为710万例
(a)https://data.who.int/dashboards/covid19/ (2) 。已出现多种SARS-CoV-2变种，每种变种的传播能力和致病性各不相同。本研究重点关注SARS-CoV-2德尔塔变种，由于其高传播性和疾病严重性，该变种对巴基斯坦人口造成了重大影响(3) 。
冠状病毒-2是一种单链、正链、多形性和有包膜的RNA病毒，外径为70-110纳米，基因组大小约为29.9 kb(4) 。病毒颗粒包含四种结构蛋白：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），这些蛋白参与病毒与宿主的相互作用(5) 。刺突蛋白（S）对于病毒进入宿主细胞至关重要，它由两个功能亚基组成：S1亚基通过与宿主血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合实现病毒附着；S2亚基促进膜融合(6) 。除了这些结构蛋白外，COVID-19病毒基因组还编码多种非结构蛋白（NSPs），包括3C样蛋白酶、解旋酶、木瓜蛋白酶样蛋白酶、2'-ZO-甲基转移酶和RNA依赖性RNA聚合酶，这些蛋白在病毒复制和致病过程中起核心作用(7) 。其中，3C样蛋白酶因在病毒复制中的关键作用而成为抗病毒药物开发的理想靶点(8) 。
主要蛋白酶（Mpro或3CLpro）存在二聚体和单体形式，但其催化活性主要体现在二聚体形式。二聚体由两个相同的亚基组成，每个亚基都包含一个催化位点——半胱氨酸-组氨酸（Cys145和His41）二聚体，位于结构域I（残基8-101）和结构域II（残基102-184）的裂隙处(9, 10, 11)。C末端结构域III（残基201-303）在稳定二聚体并调节蛋白质的别构构象方面起重要作用。此外，3CLpro的活性还受到多个灵活区域的影响，包括C环、E环和H环，以及一个引导底物结合和酶促功能的连接区，从而提供了额外的抑制位点(11) 。SARS-CoV-2的3CLpro与SARS-CoV的序列相似度为97%，仅有12个突变，且这些突变均不在蛋白质的活性口袋内(12) 。3CLpro负责将病毒编码的多聚蛋白（pp1a和pp1b）切割成16种功能性非结构蛋白（NSP1至NSP16），这是病毒复制的关键步骤(13) 。综上所述，这些特征凸显了3CLpro作为关键抗病毒药物靶点的重要性。
最初，包括法匹拉韦(14) 、瑞德西韦(15) 、羟氯喹(16) 和阿比多尔(17) 在内的抗病毒药物被用于缓解COVID-19症状，但它们的使用也与患者的整体健康状况不良有关(18, 19, 20, 21) 。此外，基于mRNA、病毒载体和T细胞的疫苗也被用于控制疾病的全球传播。然而，免疫缺陷个体的疗效降低以及新变种的出现限制了这些疫苗的有效性和长期可靠性(20, 22, 23) 。目前唯一获得FDA批准用于治疗COVID-19的药物是Paxlovid，而且药物发现过程复杂且耗时较长(24) 。因此，有必要开发替代治疗方法来有效控制冠状病毒-2感染(24) 。鉴于此，研究兴趣转向了药用植物，因为它们含有生物活性分子，可能作为预防和治疗各种疾病的药物，且副作用极少或没有(25) 。
已发现具有抗病毒活性的药用植物可以阻断SARS-CoV-2的感染性，例如Glycyrrhiza glabra (26) 、Withania somnifera (27) 和Tinospora cordifolia (28) 。我们评估了Morus alba （当地称为“Shahtoot”）的3CLpro抑制活性。Morus 属植物富含黄酮类、黄烷酮类、生物碱、苯酚酮类、萜类和香豆素衍生物(29) 。其果实、叶子和树皮提取物对多种病毒表现出抗病毒活性。例如，Morus叶的水-酒精提取物对人类冠状病毒（HCoV 229E）具有最强的抗病毒活性。Morus叶的水-酒精提取物和水提取物对小RNA病毒也有效(30) 。MA叶的乙醇提取物还对伪狂犬病病毒表现出强抗病毒活性(31) 。多项计算机模拟研究也评估了Morus alba 叶化合物对丙型肝炎病毒和SARS-CoV-2基因的抑制潜力(32, 33)，表明其是抗病毒药物开发的潜在候选者。随后，本研究利用瞬时表达模型探讨了MA甲醇提取物对SARS-CoV-2 3CLpro基因的治疗潜力。为此，将3CLpro基因克隆到哺乳动物表达载体中，并在CHO细胞中短暂表达。确定了提取物的细胞毒性，并在mRNA和蛋白质水平上评估了其抑制潜力。此外，通过分子对接分析计算评估了Morus alba 叶化合物的3CLpro抑制潜力，分子动力学模拟进一步验证了这一结果。
节选内容
质粒构建
本研究使用了SARS-CoV-2德尔塔变种（巴基斯坦来源）的3CLpro基因（926 bp）的FASTA序列。该序列从NCBI数据库（国家生物技术信息中心）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ http://www.jcat.de/ EcoRI （GAATTC）和NotI （GCGGCCGC）限制性内切酶对序列进行了处理体外
本研究利用瞬时CHO细胞模型研究了Morus alba 叶提取物对SARS-CoV-2 3CLpro基因表达的抑制潜力。讨论
尽管世界卫生组织在2023年5月宣布COVID-19公共卫生危机结束，但SARS-CoV-2病毒仍在全球范围内传播。零星疫情和新变种的出现仍然时有报道(38) 。这种持续的病毒活动凸显了开发针对关键病毒蛋白（如3C样蛋白酶3CLpro）的有效抗病毒策略的必要性(39) ，因为这些蛋白介导病毒多聚蛋白的分解为多个功能单元结论
在这项研究中，SARS-CoV-2的3CLpro基因成功克隆到哺乳动物表达系统中，用于建立药物筛选模型。无毒的MA叶提取物在mRNA和蛋白质水平上对短暂表达的3CLpro基因表现出剂量依赖性的抑制作用。在通过分子对接筛选的29种植物化学物质中，naringin显示出对3CLpro别构位点的强结合亲和力，这一点通过分子动力学模拟得到了验证CRediT作者贡献声明
Ayesha Malik： 撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件使用、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。Sobia Noreen： 撰写——审稿与编辑、数据可视化、结果验证、项目监督、实验设计、概念构思。Bushra Ijaz： 撰写——审稿与编辑、数据可视化、结果验证、项目监督、资源协调、实验实施、资金获取、数据分析、概念构思数据和材料的可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文中。
利益冲突声明
作者声明没有财务和个人利益冲突。
资助
本研究由旁遮普 高等教育委员会 （PHEC）通过旁遮普创新研究挑战奖（PIRCA）（项目编号PHEC/ARA/PIRCA/20409/18）资助。
利益冲突声明
? 作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：Bushra Ijaz表示获得了旁遮普高等教育部门的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
作者衷心感谢巴基斯坦拉合尔旁遮普大学 分子生物学卓越中心（CEMB）为这项研究提供的支持性研究环境。这项工作是提交给旁遮普大学博士论文的一部分。
