N-氨基硫脲锌(II)传感器中元取代反应的意外主导作用：增强了亲和力、灵敏度和荧光响应

《Journal of Molecular Structure》：Unexpected Dominance of Meta Substitution in N-Amidothiourea Zn(II) Sensors: Enhanced Affinity, Sensitivity and Turn-On Fluorescence

硫脲基Zn2?荧光探针中甲氧基取代位置对传感性能的影响研究表明，对位取代（2p）探针具有最高的结合亲和力（Kd=27.9 μM）和灵敏度（LOD=0.56 μM），其荧光增强机制涉及电荷转移和配位增强效应，且电子效应与空间位阻共同作用决定了不同取代位置的传感性能差异。

　　

Sergio Mendez|Jayda K. Racca|Kenechukwu C. Chikezie|Satendra Kumar|Fu-Sen Liang|Zhi-Fo Guo|Xiangyang Lei

美国德克萨斯州博蒙特市拉马尔大学化学与生物化学系，邮编77710

摘要

取代基的位置对基于硫脲的Zn²⁺传感器的性能有着深远但常被忽视的影响。在这项研究中，我们发现了一个意外的趋势：间位取代在决定结合亲和力和光物理行为方面显著优于对位和邻位取代。我们系统地研究了三种含有甲氧基的N-氨基硫脲探针，这些探针的甲氧基分别位于邻位（2o）、间位（2m）和对位（2p），并使用了紫外-可见吸收光谱、荧光光谱、核磁共振滴定、红外光谱、电喷雾质谱（ESI-MS）、Job图和密度泛函理论（DFT）计算方法进行评估。所有探针都表现出1:1的Zn²⁺结合化学计量比，但2m位置的探针具有最高的亲和力（K_d?=?27.9 μM）和灵敏度（LOD?=?0.56 μM）。在Zn²⁺结合后，出现了明显的螯合增强荧光（CHEF）现象，同时伴随着诱导电荷转移（ICT）和分子内电荷转移（MLCT）过程。值得注意的是，间位取代使荧光增强了约19倍，并且发生了显著的红移，而对位取代仅增强了约9倍；由于空间位阻和分子内氢键的作用，对位取代的荧光增强效果较弱。计算分析表明，间位取代促进了HOMO轨道的离域和轨道重叠，从而在Zn²⁺结合时缩小了带隙，而对位取代则增加了分子的刚性，阻碍了结合过程。在HeLa细胞中的活细胞成像实验验证了这些探针的生物适用性，尽管其亮度较低。这些发现揭示了一种非传统的结构-性质关系，即间位取代优于对位和邻位取代，为下一代基于硫脲的Zn²⁺传感器提供了有用的设计原则，以实现更高的选择性和更好的荧光响应。

引言

荧光化学传感器（探针）由于其出色的灵敏度、选择性和在多种化学及生物环境中的通用性，已成为不可或缺的分析工具[1]。这些传感器通过调节荧光参数（如强度、发射波长或寿命）来响应特定分析物的存在，从而实现对从金属离子[2]、小有机分子[3]到生物大分子[4]等目标的实时、无创检测和定量。它们的广泛应用包括有毒金属和污染物的环境监测[5]、通过生物标志物识别进行生物医学诊断（如癌症、糖尿病和神经退行性疾病[6]，以及用于高空间和时间分辨率下观察细胞内过程的细胞和分子生物学应用[7]。材料科学和纳米技术的最新进展进一步改善了探针的设计，提高了其在水中的溶解度、光稳定性和多分析物检测能力，从而扩展了其功能范围和分析精度[8]。

锌离子（Zn²⁺）在生物系统中起着重要作用，参与酶催化、基因调控和细胞信号传导[9]。健康生物体内的锌离子浓度受到严格调控，Zn²⁺稳态的破坏与阿尔茨海默病、糖尿病和免疫系统疾病等病症有关。使用原子吸收光谱、电感耦合等离子体质谱、滴定等传统方法检测Zn²⁺通常耗时较长且需要长时间样品制备。此外，这些方法在实时数据采集方面存在局限性。相比之下，荧光化学传感器具有更快的数据采集速度、高灵敏度和选择性，并且能够在含有许多干扰物质的生物和环境基质中进行实时检测。在这方面，基于硫脲的配体作为有前景的Zn²⁺化学传感器应运而生。它们通过氮原子和硫原子进行双齿结合，能够精确控制金属结合的几何结构，同时其模块化结构允许精细调节电子和空间性质，从而增强结合亲和力和荧光响应。尽管已有大量关于Zn²⁺传感器的报道[10]，但基于硫脲骨架的荧光探针仍然相对较少[11]。因此，迫切需要开发出选择性高、水溶性好、能穿透细胞壁的探针，这些探针能够在水相和生物相关环境中产生强烈的荧光响应[12]。解决这一挑战对于深入理解锌在健康和疾病中的动态作用至关重要[13]。

取代基通过改变荧光化学传感器的电子和空间结构，对灵敏度和选择性起着关键作用[14]。供电子的基团（如-OH、-OCH₃、-NH₂、烷基链）通常通过增加电子密度和稳定激发态来增强荧光，从而改善信号响应；而吸电子的基团（如-NO₂、-CN、-COOH、-CF₃、卤素）则会减弱荧光或引起光谱位移，从而影响检测限和目标识别能力。此外，大体积取代基会产生空间效应，改变结合亲和力；而具有氢键或金属结合能力的官能团则提供了额外的识别途径。因此，理解这些取代基的影响对于合理设计化学传感器至关重要。

我们之前的工作[15]表明，含有供电子甲氧基的N-氨基硫脲对Zn²⁺具有高选择性和灵敏度，且不受生物相关阴离子的影响。随后，我们开发了含有吡啶核心的双硫脲和单硫脲配体，这些配体能够选择性检测Zn²⁺并在活细胞中进行质膜成像[16,17]。这些研究揭示了配体结构和供电子原子排列对荧光响应和生物定位的重要性。

在这项研究中，我们系统地研究了三种在芳香环上对位（2p）、间位（2m）和邻位（2o）位置含有甲氧基取代的N-氨基硫脲配体，探讨了这些位置变化如何影响Zn²⁺的识别、荧光增强和选择性。通过光谱表征、计算建模和活细胞成像的结合，我们建立了具有优化性能的基于硫脲的荧光探针的设计原则。

这项研究颠覆了传统的观点，即供电子的甲氧基主要在邻位[18]和对位[19]位置增强传感器性能。我们的发现表明，间位取代能够提供更好的光物理响应和Zn(II)传感效率，揭示了一个之前未被认识到的设计原则。这一范式转变为生物和环境应用中的荧光化学传感器的合理开发提供了新的框架。

部分内容摘录

一般信息

所有试剂均可从商业渠道获得。¹H NMR（400 MHz）和¹³C NMR（101 MHz）实验在Bruker Ascend 400 MHz光谱仪上进行。质谱分析分别在Agilent Q-TOF和Bruker Daltonics Bio TOF质谱仪上进行。红外光谱在Nicolet iS20 FT-IR光谱仪上测量，测量范围为4000 cm^-1 - 4000 cm^-1。紫外-可见光谱在Evolution 260 Bio UV-visible光谱仪上获得。荧光光谱由Shimadzu仪器测量。

结果与讨论

配体按照第2.2节中描述的步骤合成。肼与等量的甲氧基苄基异硫氰酸酯在乙腈中在剧烈回流条件下反应六小时，生成了所需的配体。通过NMR、红外和电喷雾质谱等综合分析方法对化合物进行了表征，确保了其准确性和纯度，为后续的荧光光谱实验做好准备。

结论

本研究揭示了基于硫脲的Zn²⁺荧光探针中的一种非传统的结构-性质关系：间位取代在促进螯合增强荧光（CHEF）、优化电荷转移路径和确保Zn²⁺选择性方面明显优于对位和邻位取代。通过确定间位取代是主导因素，我们为设计具有更好性能的下一代传感器提供了实用指导原则。

作者贡献

Sergio Mendez：研究、方法论、数据收集、数据分析及软件应用。Jayda K. Racca：研究、方法论、数据收集、数据分析及软件应用。Kenechukwu C. Chikezie：数据收集。Satendra Kumar：细胞成像。Fu-Sen Liang：细胞成像的监督与验证。Xiangyang Lei：撰写、审稿与编辑。Zhi-Fo Guo：项目监督、管理、概念构思、资金筹集及手稿审稿与编辑。所有作者均参与了本研究。

作者贡献声明

Sergio Mendez：软件开发、方法论设计、数据分析。Jayda K. Racca：资源协调、方法论设计、数据分析。Kenechukwu C. Chikezie：数据管理。Satendra Kumar：数据管理。Fu-Sen Liang：结果验证与监督。Zhi-Fo Guo：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、项目监督、资金筹集及概念构思。Xiangyang Lei：撰写、审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢Welch基金会（V-0004项目）和拉马尔大学提供的启动资金支持。