LC-MS/MS代谢物分析、分子网络构建以及Hornstedtia conoidea和Etlingera elatior提取物的环氧化酶抑制活性研究：体外与计算机模拟的见解
《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》：LC-MS/MS metabolite profiling, molecular networking and cyclooxygenase inhibition activity of Hornstedtia conoidea and Etlingera elatior extracts: In vitro and in silico insights
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抗炎活性研究显示，菲律宾特有植物Hornstedtia conoidea和常见植物Etlingera elatior的甲醇-水提物均能抑制COX-1和COX-2酶活性，其中EE抑制效果更强。通过LC-MS/MS代谢组学结合分子模拟发现，两者均含多酚类化合物，酚类成分差异是代谢分化的主因，且氰苷糖苷更倾向抑制COX-2。
杰森·C·阿尔卡诺（Jason C. Alcano）|安娜·卡伦·C·拉塞纳（Anna Karen C. Laserna）|马克·特里斯坦·J·奎姆克（Mark Tristan J. Quimque）|迪安·黑兹尔·D·佩洛贝洛（Deanne Hazel D. Pelobello）|德雷克塞尔·H·卡马乔（Drexel H. Camacho）|吉娜·B·巴尔博萨（Gina B. Barbosa）
菲律宾布基德农省马拉马格市穆苏安（Musuan），大学城（University Town），中棉兰老大学（Central Mindanao University）化学系，邮编8714
摘要
炎症是一种复杂的生理反应，与感染性疾病和代谢性疾病有关。尽管非甾体抗炎药（NSAIDs）通过抑制环氧化酶（COX）有效减轻炎症，但它们对不同COX异构体的选择性较差，常常导致胃肠道和肾脏副作用。为了探索天然替代品，研究了两种姜科植物——Etlingera elatior（EE）的花序和菲律宾特有物种Hornstedtia conoidea（HC）的果实部分的抗炎活性及非靶向代谢物谱。基于LC–MS/MS的代谢物分析结合分子网络分析显示，这两种植物中含有多种多酚类植物化学物质。EE和HC的甲醇-水粗提物在体外实验中均能抑制COX活性，其中EE的抑制作用更强。分子对接实验表明，多酚类物质对两种COX异构体具有中等到强的结合亲和力，寡聚原花青素更倾向于结合COX-1，而黄酮苷则更倾向于结合COX-2。对排名靠前的复合物进行的分子动力学模拟证实了配体的稳定结合、结构完整性的保持以及异构体特异性的稳定模式。比较代谢组学分析表明，EE和HC之间的差异主要由酚类化合物引起，其中氰苷类化合物在理论上的结合偏好上更倾向于COX-2异构体。总体而言，这种结合代谢组学、生物测定和计算建模的综合策略为EE和HC作为天然COX抑制剂提供了分子层面的支持。
引言
炎症是一种自然的生理过程，发生在体内稳态受到严重干扰时，例如当外来物质引起感染或身体受伤时，其目的是控制炎症介质的扩散并促进受损组织的修复[1]。炎症级联反应是细胞因子、免疫信号传导和代谢物之间的复杂相互作用，形成了一个涉及免疫、生理和行为事件的网络。参与炎症的关键途径之一是花生四烯酸催化转化为炎症介质前列腺素。人体内前列腺素的生物合成途径始于花生四烯酸通过磷脂酶A2的作用从膜脂质中释放出来。花生四烯酸可以通过环氧化酶（COX）和脂氧合酶两条独立途径转化为其他代谢产物。环氧化酶在前列腺素和血栓烷的形成中起关键作用，因此抑制环氧化酶有助于控制炎症[2],[3]。目前已知有两种环氧化酶异构体：COX-1和COX-2。COX-1主要在大多数组织中持续表达，与某些对正常生理功能至关重要的前列腺素的合成有关，包括胃黏膜保护、血流调节和肾功能支持[4]。相比之下，COX-2的产生主要是对刺激的反应。虽然COX-2在某些器官中也可以持续表达，但它会促进炎症和疼痛，这使得COX-2成为开发抗炎药物的关键靶点。
传统的非甾体抗炎药（NSAIDs）常用于疼痛和炎症的治疗。这些抑制剂通过阻断COX-2的活性来减少与炎症相关的生理反应，如水肿、由于血管扩张引起的红斑、免疫细胞募集和疼痛敏感性[2],[5]。然而，NSAIDs对可诱导的COX-2异构体没有选择性，同时也会阻断COX-1的重要生理功能，从而导致包括胃肠道毒性、肾脏紊乱和心血管副作用在内的不良副作用[6]。因此，人们一直在努力从自然界中寻找新的药物候选物，以实现更有效且副作用更小的炎症管理。
姜科植物（Zingiberaceae），通常被称为姜，长期以来被认为含有具有多种生物活性的植物化学物质，包括抗炎活性[7]。属于该科的普通姜Zingiber officinale在系统评价和荟萃分析中被证明可以通过显著降低抗炎和氧化应激标志物来有效管理炎症[8],[9]，并且安全性良好，且没有NSAIDs相关的肾脏风险。姜衍生的植物化学物质还被发现对炎症中的关键酶（如前列腺素（PG）合成酶[10]、COX-2[11]和花生四烯酸5-脂氧合酶[10]具有强抑制作用。这些药理效应主要归因于其中丰富的多酚类和结构多样的化合物，对人体有益。
鉴于寻找天然抗炎替代品的需要，研究姜科家族中其他尚未充分研究的成员也是值得的，例如菲律宾特有的Hornstedtia conoidea（HC）以及更为常见的Etlingera elatior（EE）。Barbosa等人首次对HC的叶片和根茎进行了基于GC-MS的代谢物分析[12]，发现其中含有潜在的抗炎活性化合物。然而，该分析仅涵盖了挥发性和衍生非挥发性化合物，限制了化学覆盖范围。此外，先前的研究还表明HC的叶片和根茎具有很好的抗氧化能力[13],[14]。由于自由基与氧化应激相关的炎症密切相关，抗氧化化合物可以中和活性氧，从而调节炎症途径[15]。
基于此理由，通过抑制COX-1和COX-2酶，在体外评估了EE花序和HC果实部分的甲醇-水粗提物的抗炎活性。结合化学分子网络的代谢物分析用于描述、比较和注释多模态LC-MS/MS数据中的植物化学物质，这是一种在植物提取物分析中有效的工作流程[16],[17]。通过计算机模拟研究了植物化学物质与两种COX异构体的结合情况，以了解底物-酶结合机制和相互作用。本研究整合了代谢物分析、体外酶抑制实验和计算机模拟，以揭示所研究植物的抗炎潜力。
部分摘录
化学物质和试剂
实验中使用的化学物质和试剂均为分析级（AR）纯度。LC-MS分析使用了质谱级（MS）溶剂。提取和酶测定使用了超纯水（Wasserlab，西班牙纳瓦拉）。来自绵羊的环氧化酶-1（COX-1）和来自人类的重组环氧化酶-2（COX-2）购自Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
样品采集与制备
植物样品采集地点为菲律宾布基德农省马拉马格市穆苏安的中央棉兰老大学（Central Mindanao University）College Park，坐标为7° 51’
粗提物的LC-MS/MS谱图与分子网络分析
利用LC-MS/MS和分子网络分析对植物样品进行了代谢物分析，以了解提取物中可能与观察到的抗炎活性相关的植物化学物质。这种策略是系统地重复和探索生物活性植物提取物中天然产物的有效工具[29]。图S2展示了正离子化和负离子化模式下植物提取物的代表性基峰色谱图（BPCs）
结论
本研究结合了非靶向LC–MS/MS代谢组学、体外环氧化酶抑制实验和计算建模，阐明了Etlingera elatior花序和菲律宾特有物种Hornstedtia conoidea果实部分的抗炎潜力。代谢组学分析显示这两种植物中都含有多酚类化合物，比较分析表明酚类化合物是导致它们代谢差异的主要因素。两种提取物在体外实验中均能抑制COX活性
资助
本研究得到了菲律宾科学技术部-健康研究与发展委员会（DOST-PCHRD）在天然产物研究方面的资助。此外，还获得了DOST-科学教育研究所（SEI）奖学金和“女性在质谱技术中的赋权奖”（FeMS Empowerment Award）的额外研究资金。
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT和Google
CRediT作者贡献声明
安娜·卡伦·卡拉斯科（Anna Karen Carrasco）：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、软件使用、资源协调、项目管理、方法设计、实验设计、数据分析、概念化。马克·特里斯坦·J·奎姆克（Mark Tristan J. Quimque）：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、软件使用、实验设计、数据分析、数据分析。杰森·C·阿尔卡诺（Jason C. Alcano）：写作——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、软件使用、资源协调、项目管理
作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
J.C.A.和G.B.B.感谢Glenn Mark Presores在样品采集和代谢组学样品制备方面的协助，以及Edsel Tan在环氧化酶实验中的帮助。作者还要感谢已故的Melania M. Enot博士提供实验室设施的支持。最后，感谢天然产物研究与发展中心、CMU Tuklas Lunas项目（项目5）以及DLSU Central的支持
