《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：Single-cell and spatial transcriptomics identify PGK1-sensitized hypoxia macrophages as a therapeutic target to overcome PDT resistance in glioma
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光动力疗法（PDT）诱导的肿瘤缺氧导致巨噬细胞代谢重编程（PGK1磷酸化PDHK1增强糖酵解），并通过SPP1-CD44旁分泌轴促进胶质瘤侵袭耐药。靶向PGK1/SPP1可逆转代谢异常并增强PDT疗效，为胶质瘤治疗提供新策略。
Xiuwei Yan|Jiahe Hu|Xuyan Han|Lei Xu|Lihui Zhou|Jiaoyan He|Fei Yang|Longgang Zhou|Yapeng Niu|Mo Geng|Wenjie Yuan|Dong Zhao|Jianyang Du|Shaoshan Hu
浙江省人民医院神经外科肿瘤中心，杭州医学院附属医院，中国杭州310014
摘要
胶质瘤对光动力疗法（PDT）的耐药性主要由治疗引起的缺氧驱动，但缺氧相关巨噬细胞（Hypoxia-TAM）的具体作用仍不清楚。通过整合PDT治疗前和治疗后复发的（RP-PDT）人类胶质瘤样本的单细胞和空间转录组数据，并结合功能检测，我们发现Hypoxia-TAM是耐药性的关键介质。这些细胞经历了显著的糖酵解重编程，这一过程由磷酸甘油酸激酶1（PGK1）调控。我们证明PGK1磷酸化丙酮酸脱氢酶激酶1（PDHK1），从而强化了糖酵解状态。此外，PGK1驱动的Hypoxia-TAM通过骨桥蛋白（SPP1）-CD44旁分泌轴促进胶质瘤进展，这一相互作用在RP-PDT样本中通过共免疫沉淀得到证实。通过基因靶向PGK1或SPP1可以恢复Hypoxia-TAM的氧化代谢，抑制胶质瘤侵袭性，并与PDT联合使用以延缓肿瘤生长并延长原位模型中的生存期。我们的发现揭示了以PGK1为中心的代谢-旁分泌轴在胶质瘤耐药性中的作用，为胶质瘤的治疗提供了新的靶点。
引言
胶质瘤是成人中最常见和最具侵袭性的原发性颅内恶性肿瘤，其特征是浸润性生长，尽管采用了包括最大安全切除、放疗和替莫唑胺化疗在内的多模式标准治疗，预后仍然较差[1] [2]。这种治疗失败的一个根本原因是高度异质性和强烈的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）[3] [4]。在这个复杂的生态系统中，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是主要的免疫细胞类型。虽然TAM具有发挥抗肿瘤功能的能力，但它们会极化为一种称为Hypoxia-TAM的促肿瘤表型[5] [6] [7]。
光动力疗法（PDT）作为一种局部治疗手段，在通过活性氧（ROS）诱导细胞毒性和增强抗肿瘤免疫方面显示出潜力[8] [9]。然而，PDT的临床应用常常受到一个基本生理悖论的制约：该疗法消耗分子氧来产生ROS，从而加剧了肿瘤内的缺氧。当初始肿瘤氧合水平较低时，这种效应尤为明显，而这在胶质瘤中很常见，也是导致PDT耐药性的一个因素[10] [11]。这种治疗引起的缺氧应激作为一种强大的进化压力，选择了耐药表型并巩固了免疫抑制性的Hypoxia-TAM群体。尽管在复发性胶质瘤中这些细胞的富集已有充分记录，但调控其代谢适应性和持续免疫抑制功能的精确分子机制仍不清楚[12] [13] [14]。因此，迫切需要识别Hypoxia-TAM中更精确且可操作的代谢节点，以破坏其促肿瘤功能。
为了解决这一关键问题，我们对PDT治疗前和治疗后复发的（RP-PDT）临床样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。通过差异表达分析和代谢途径富集，我们发现磷酸甘油酸激酶1（PGK1，一种关键的糖酵解酶）是耐药性髓系细胞中显著上调的候选基因。基于这一筛选结果，并结合关于糖酵解酶非经典功能的现有文献，我们假设PGK1作为关键的代谢开关，通过磷酸化丙酮酸脱氢酶激酶1（PDHK1，线粒体代谢的调节因子）来强化糖酵解并维持Hypoxia-TAM状态[15] [16]。
此外，我们探讨了其功能影响，发现PGK1驱动的糖酵解促进了骨桥蛋白（SPP1，一种促肿瘤细胞因子）的分泌，后者激活胶质瘤细胞表面的CD44受体，从而促进间充质转化和肿瘤复发[17] [18] [19]。通过结合单细胞转录组学的发现能力和原位小鼠模型中的严格实验验证，本研究确立了PGK1-pPDHK1（磷酸化的PDHK1）相互作用作为一个新的可药物靶点。最终，我们的发现为针对这一特定的代谢脆弱性提供了机制框架，为将PDT引起的缺氧屏障转化为治疗机会提供了转化策略。
临床样本收集
从接受PDT治疗的三名胶质瘤患者中获取了配对的肿瘤样本（PDT治疗前和RP-PDT）。对照组包括12名接受标准治疗（手术加辅助化疗）的胶质瘤患者，其中6人为原发性肿瘤患者，6人为复发性肿瘤患者，根据复发间隔进行了匹配。
小鼠
从上海SLAC实验动物有限公司购买了6-8周龄、体重18-22克的雌性BALB/c裸鼠，饲养在温度22±2°C、湿度50-55%的SPF条件下。单细胞和空间转录组分析揭示了PDT治疗前和RP-PDT期间胶质瘤的细胞特征
为了研究PDT治疗后复发性胶质瘤的TME特征，我们对三名胶质瘤患者治疗前（PDT治疗前）和RP-PDT时的配对肿瘤样本进行了scRNA-seq分析。共有40,444个通过初步质量控制的细胞被用于构建全面的胶质瘤图谱（图1A）。根据高表达基因模式识别出主要的细胞群体（图S1A-D）。随后通过UMAP进行降维处理
讨论
本研究阐明了胶质母细胞瘤对PDT适应性耐药性的关键机制，表明治疗引起的缺氧驱动TAM向促肿瘤状态的重编程[32] [33] [34]。PDT消耗肿瘤内的氧气以产生细胞毒性ROS，同时加剧了肿瘤缺氧——这种缺氧应激作为关键的选择压力触发了适应性耐药性。缺氧驱动单核细胞衍生的TAM极化为Hypoxia-TAM，表现出明显的
CRediT作者贡献声明
Xiuwei Yan：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，资金获取，正式分析，数据管理，概念构思。Jiahe Hu：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，方法学设计，正式分析，数据管理。Xuyan Han：方法学设计，正式分析，数据管理。Lei Xu：撰写 – 初稿，数据可视化。Lihui Zhou：方法学设计，正式分析，数据管理。Jiaoyan He：数据可视化，验证。Fei Yang：软件应用，数据管理。Longgang Zhou：
伦理批准和参与同意
该研究方案已获得浙江省人民医院伦理委员会的批准（QT2024251），并按照《赫尔辛基宣言》进行，所有参与者均签署了书面知情同意书。
代码可用性
本研究涉及的生物信息学分析代码可在特定条件下提供。如有需要，请通过合理途径联系相应作者。资助
本研究得到了浙江省人民医院人才引进项目（编号C-2021-QDJJ03-01）、浙江省医药科技项目（编号2024KY015）、杭州医学院基础科研经费（编号KYQN2024006）、国家自然科学基金（编号82203472）、山东省自然科学基金（编号ZR2024QH042）以及2023年山东省医学会青年人才支持项目的支持。致谢
作者感谢TCGA、CGGA和MSigDB等数据库提供的数据集访问便利。同时，感谢Siwen Wang在数据分析和鼓励方面的帮助。
