新型环状RNA hsa_circ_0000313通过调控miR-1224-3p/MKNK2轴激活p38 MAPK信号通路，在重症肌无力CD4+T细胞中的作用机制研究

《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Hsa_circ_0000313/miR-1224-3p/MKNK2 Axis Modulates CD4+ T Cells by Activating p38 MAPK Signaling in Myasthenia Gravis

本研究聚焦于重症肌无力（MG）这一自身免疫性疾病的分子机制，探索了环状RNA hsa_circ_0000313在该病理过程中的作用。研究人员通过构建hsa_circ_0000313/miR-1224-3p/MKNK2调控轴模型，揭示了其在MG患者CD4+T细胞中高表达，并通过ceRNA机制激活p38 MAPK通路，从而促进炎症因子分泌、细胞增殖并抑制凋亡。该研究为深入理解MG发病机制提供了新视角，并揭示了hsa_circ_0000313作为潜在治疗靶点的可能性。

　　

想象一下，控制你每一次眨眼、微笑或走路的神经肌肉连接突然失灵，这就是重症肌无力（MG）患者可能面临的困境。MG是一种由自身抗体攻击神经-肌肉接头（NMJ）引起的自身免疫性疾病，其典型症状包括眼睑下垂、复视、吞咽困难和全身性无力。尽管已有针对性的药物治疗，但长期用药可能引发感染等并发症，且仍有约10%的患者无法检测到相关自身抗体（血清阴性MG）。此外，T细胞过度活化和功能失衡，特别是CD4⁺T细胞的异常，是驱动疾病进展的核心环节。然而，驱动这些免疫细胞异常活化的“幕后推手”究竟是谁？其背后的分子机制尚未被完全阐明。近年来，科学家们将目光投向了基因组的“暗物质”——非编码RNA。其中，环状RNA（circRNA）因其特殊的环状结构而异常稳定，在包括MG在内的多种自身免疫性疾病中发挥着“分子海绵”般的调控作用。为了在MG这片迷雾重重的领域寻找新的线索，研究人员从哈尔滨医科大学附属第二医院招募了50名患者和50名健康对照，展开了一项探索，并将研究成果发表在《MEDIATORS OF INFLAMMATION》上。

研究人员开展此项研究的关键方法包括：从患者和对照者外周血中分离单个核细胞（PBMC），利用Jurkat细胞（人CD4⁺T细胞白血病细胞系）作为体外研究模型。通过琼脂糖凝胶电泳、RNase R消化和Sanger测序验证环状RNA的结构特性，并通过核质分离实验和FISH（荧光原位杂交）技术确定其亚细胞定位。基因表达分析依赖于实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。功能学实验则通过CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞术分析细胞凋亡，ELISA检测炎症因子（TNF-α, IL-6, IL-10）分泌。分子间相互作用通过双荧光素酶报告基因实验验证，信号通路蛋白表达通过Western Blot进行检测。

4. 结果

4.1. hsa_circ_0000313在MG患者中高表达

研究人员首先从先前的芯片测序数据中筛选出差异表达的circRNA，并锁定了一个候选分子hsa_circ_0000313。通过一系列严谨的实验验证，证实了它在PBMC和Jurkat细胞中确实是一个环状分子，能抵抗RNase R的降解，并且主要定位于细胞质。更重要的是，与健康人相比，MG患者血液中hsa_circ_0000313的表达水平显著升高。在Jurkat细胞中敲低hsa_circ_0000313后，细胞增殖和炎症因子分泌受到抑制，而细胞凋亡则被促进。

4.2. hsa_circ_0000313是miR-1224-3p的“分子海绵”

既然hsa_circ_0000313定位于细胞质，研究人员猜测它可能通过吸附微小RNA（miRNA）来发挥作用。通过数据库预测和实验验证，他们发现miR-1224-3p是hsa_circ_0000313的直接靶点。在MG患者中，miR-1224-3p的表达水平与hsa_circ_0000313呈负相关，并且在细胞中显著降低。双荧光素酶报告基因实验证实了二者之间的直接结合，FISH实验则直观地显示了两者在细胞质中共定位。

4.3. hsa_circ_0000313通过调控miR-1224-3p影响细胞功能

功能挽救实验进一步证实了二者之间的调控关系。在Jurkat细胞中过表达miR-1224-3p模拟物，能产生与敲低hsa_circ_0000313相似的效果——抑制增殖、促进凋亡、减少炎症因子分泌。而当在敲低hsa_circ_0000313的同时，抑制miR-1224-3p的功能，则可以“挽救”敲低hsa_circ_0000313产生的表型，使细胞功能恢复。这表明hsa_circ_0000313正是通过“吸附”并抑制miR-1224-3p，来发挥其促炎、促增殖作用的。

4.4. miR-1224-3p直接靶向MKNK2

接下来，研究人员开始寻找miR-1224-3p的下游靶基因。通过多个数据库预测和文献查阅，他们锁定了MNK2（MAPK相互作用激酶2，MKNK2）基因。与hsa_circ_0000313的变化趋势一致，MKNK2在MG患者中也高表达，且与miR-1224-3p负相关，与hsa_circ_0000313正相关。双荧光素酶报告基因实验证明，miR-1224-3p可直接结合MKNK2的3‘非翻译区（3’UTR）。在细胞中敲低hsa_circ_0000313或过表达miR-1224-3p，都会导致MKNK2的mRNA和蛋白水平下降。反之，在敲低hsa_circ_0000313或MKNK2的同时抑制miR-1224-3p，则可以逆转MKNK2表达的下调。这清晰地勾勒出hsa_circ_0000313 / miR-1224-3p / MKNK2这条调控轴。

4.5. hsa_circ_0000313/miR-1224-3p/MKNK2轴通过激活p38 MAPK通路发挥作用

MKNK2是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路下游的关键激酶。为了验证这条轴是否最终通过激活经典信号通路来起作用，研究人员在用脂多糖（LPS）刺激Jurkat细胞（模拟炎症感染状态）后，检测了p38 MAPK信号通路的激活情况。结果发现，敲低hsa_circ_0000313或MKNK2，都能显著抑制p38的磷酸化水平。更重要的是，这些功能效应（抑制增殖、促进凋亡、减少炎症）可以被miR-1224-3p的抑制剂所逆转。这最终证明，在MG的炎症背景下，高表达的hsa_circ_0000313通过吸附miR-1224-3p，解除了后者对MKNK2的抑制，进而激活MKNK2下游的p38 MAPK信号通路，最终驱动CD4⁺T细胞的异常活化和炎症反应。

这项研究最终揭示，hsa_circ_0000313是MG疾病进展中的一个关键促炎分子。它通过ceRNA（竞争性内源RNA）机制吸附miR-1224-3p，上调其靶基因MKNK2的表达，从而激活p38 MAPK信号通路，最终导致CD4⁺T细胞过度增殖、炎症因子分泌增加和凋亡受抑。这一发现不仅为理解MG的免疫失调机制提供了全新的视角——从一个全新的非编码RNA调控网络角度阐释了CD4⁺T细胞活化的精细调控，更重要的是，它将hsa_circ_0000313及其调控轴（hsa_circ_0000313/miR-1224-3p/MKNK2/p38 MAPK）推向了舞台中央，作为一个潜在的新型生物标志物和治疗靶点。未来，针对该轴的干预策略，例如设计靶向hsa_circ_0000313的反义寡核苷酸（ASO），或开发MKNK2的小分子抑制剂，或许能为MG患者，特别是那些伴有难治性炎症感染的患者，带来更精准、更有效的治疗选择。