《MedComm》：High-Purity Functional Corneal Endothelial Cells From Human Induced Pluripotent Stem Cells via a Novel Wash-Out Method
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本刊推荐：为应对角膜内皮功能障碍（CED）治疗中供体短缺的难题，研究人员针对性地开展了利用诱导多能干细胞（iPSCs）分化生成角膜内皮样细胞（CECs）的新方法研究。他们成功开发了一种新颖、高效、无细胞毒性的“冲洗”方案，显著提升了iPSC-CECs的纯度与功能性。单细胞测序证实，所获得的细胞与原发性人CECs高度相似，并在动物模型中展现了卓越的治疗效果与安全性。该研究为建立可规模化生产的、高质量的干细胞治疗平台提供了有力支持，是再生医学领域一项极具潜力的突破。
角膜，这扇我们感知世界的“窗户”，其清澈透明至关重要。角膜最内层的角膜内皮（Corneal Endothelium），由单层六边形细胞构成，扮演着“水泵”和“屏障”的双重角色，通过主动运输水分来维持角膜的脱水状态，从而保证其透明度。然而，这些细胞在成年后基本丧失了增殖能力。一旦因老化、外伤、手术（如白内障手术）或遗传性疾病（如Fuchs角膜内皮营养不良，FECD）等原因导致角膜内皮细胞大量损失，角膜就会发生水肿、混浊，最终致盲。
目前，角膜移植是治疗角膜内皮功能障碍（Corneal Endothelial Dysfunction, CED）的唯一有效方法。但全球范围内都存在严重的供体角膜短缺问题，且手术费用高昂，对医生技术要求高。尽管诸如后弹力层剥离角膜内皮移植术（DSAEK/DMEK）等新技术提高了疗效，但“巧妇难为无米之炊”，供体短缺始终是最大的瓶颈。
于是，科学家们将目光投向了再生医学的明星——诱导多能干细胞（induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）。iPSCs理论上可以无限增殖，并能分化为几乎任何类型的体细胞，为解决供体短缺带来了曙光。然而，从iPSCs高效、稳定地分化出高纯度、功能完善的角膜内皮样细胞（Corneal Endothelial-like Cells, CECs），并确保其临床应用的安全性（特别是去除未分化的、有致瘤风险的iPSCs），是领域内亟待攻克的核心难题。
近期，一篇发表在《MedComm》上的研究为我们带来了令人振奋的解决方案。以Eun Young Lee和Hun Lee为通讯作者的研究团队，成功开发了一种基于“冲洗法”的全新策略，能够从临床级人iPSCs中高效产生高纯度、功能性的CECs，并在动物模型中验证了其显著的治疗效果与安全性，为CED的细胞治疗迈出了关键一步。
为了开展这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术：首先，建立了两种iPSCs分化为CECs的 protocol，一种经神经嵴细胞（NCC）阶段（ACE1），另一种直接分化（ACE2），并创新性地引入了基于细胞黏附差异的“冲洗”纯化步骤。其次，利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）对iPSC-CECs、原发性人CECs等七组细胞群体进行了全面的转录组学分析与拟时序轨迹推断。第三，通过免疫细胞化学、蛋白质印迹、流式细胞术、跨上皮/内皮电阻（TEER）测量等多种体外实验，系统评估了分化细胞的表型、纯度与功能。第四，建立了兔角膜内皮功能障碍（CED）模型（包括后弹力层剥离和内皮刮除两种），并进行了iPSC-CECs的前房内移植，长期观察角膜透明度恢复、细胞存活及免疫反应情况。最后，通过PCR检测人源性线粒体DNA和Alu重复序列，分析了移植细胞在宿主体内的存活与生物分布。研究所用临床级人iPSCs由合作单位Yipcell Inc.提供，原发性人CECs来源于眼库捐赠者。
研究结果
2.1 从hiPSC诱导的CEC表征：直接分化
研究人员比较了经NCC阶段（ACE1）和直接（ACE2）两种分化途径。他们发现，直接分化的细胞能够表现出典型的CEC六边形形态，并高表达ZO-1、ATP1A1、SLC4A11、N-CADHERIN、CD166和NCAM等CEC特异性标志物。核心创新在于“冲洗”法：利用分化程度更高的CECs能更快、更牢固地黏附在玻连蛋白（VTN）涂层表面的特性，通过轻柔洗去未充分黏附的细胞（多为未分化或分化不完全的iPSCs），从而高效提高CEC群体的纯度。该方法简单、无细胞毒性，且成本低廉。
2.2 单细胞分析揭示CEC特征及iPSC–CECs的优越性
通过对七组细胞（包括不同分化条件的iPSC-CECs和两例原发性人CECs）进行单细胞测序，研究发现，采用“冲洗”法且使用无动物源成分（AOF）培养基CTS-DMEM培养的ACE2W.DM14群体，在转录组层面与原发性人CECs（hCECs）相似度最高。该群体高表达典型CEC标记基因（如TJP1、ATP1A1），而多能性基因（如NANOG、POU5F1）表达细胞极少，证明“冲洗”法有效去除了未分化干细胞。拟时序分析显示，ACE2W.DM14和ACE2W21（分化21天）群体表现出更成熟、更接近hCECs的细胞状态。
2.3 iPSC–CECs与原发性hCECs的功能相似性
基因本体（GO）功能富集分析表明，ACE2W21群体与hCECs在细胞外囊泡、黏着斑、线粒体蛋白复合物、氧化还原酶活性、生长因子结合等功能上具有高度相似性，提示其具备强大的代谢、组织维持和修复潜能。相比之下，未经“冲洗”的ACE2群体更富集于细胞黏附、代谢调节相关通路，而经NCC阶段分化的ACE1群体则残留神经嵴相关基因特征。
2.4 分化为功能性、高纯度CECs：“冲洗”法的功效
蛋白质印迹证实“冲洗”组CEC标志物蛋白表达稳健。跨上皮/内皮电阻（TEER）测量显示，“冲洗”能显著增强细胞连接屏障的完整性。流式细胞术定量分析显示，在分化第21天，“冲洗”组中高质量CEC标志物CD166阳性的细胞比例高达98%，而未“冲洗”组比例较低。实时定量PCR（RT-qPCR）也证实，“冲洗”能几乎完全消除iPSC多能性基因（OCT4, NANOG）的表达，同时提升CEC基因（CDH2）的表达。
2.5 iPSC–CEC移植的治疗功效
在兔CED模型中，将iPSC-CECs注射入前房。结果显示，所有移植组（ACE1, ACE2, ACE2W, ACE2W.DM）的角膜透明度均随时间显著恢复，角膜厚度因水肿消退而恢复正常。其中，使用“冲洗”后细胞（ACE2W）移植的模型，角膜混浊的改善早在移植后1周即可观察到，而未“冲洗”细胞（ACE2）组则在4周后才显现效果，证明了高纯度细胞群体的治疗优势。
2.6 宿主眼中移植CECs的检测
通过PCR检测人源性线粒体DNA、蛋白质印迹和免疫组织化学染色，研究证实移植的人iPSC-CECs能够在宿主兔角膜内皮上存活并整合，最长检测到移植后48周。双标染色（人源特异性标志物STEM121和CEC标志物N-CADHERIN或ZO-1）直观显示了存活移植细胞的存在。“冲洗”组在早期表现出更好的细胞黏附与单层连续性。重要的是，在所有检查时间点（最长达16周），移植区域均未检测到T细胞（CD4+, CD8+）或巨噬细胞/中性粒细胞（CD11b+）的免疫激活，表明角膜的免疫豁免权得以维持，未发生明显的免疫排斥反应。
2.7 移植细胞的体内生物分布
在小鼠CED模型中，通过PCR定量检测人Alu重复序列，分析了移植后0、1、7、14天时iPSC-CECs在主要器官中的分布。结果显示，人源DNA主要局限于接受移植的眼睛内，并随时间推移逐渐减少。在其他器官（肺、脾、肾、肝、心、脑）及对侧眼中，仅检测到极微量或检测不到人源DNA。移植后14天，所有被检组织均未检出人源DNA。在兔模型长达48周的观察中也未发现肿瘤形成或异位移植迹象，证明了治疗的安全性。
研究结论与讨论
本研究成功建立了一种利用“冲洗”法从临床级人iPSCs高效产生高纯度、功能性CECs的全新平台。综合而言，直接分化途径（ACE2）优于经NCC阶段的分化，而结合“冲洗”法后，其产物（特别是ACE2W21和ACE2W.DM14群体）在转录组、蛋白表达、细胞纯度和功能上均与原发性人CECs表现出最高的相似度。
“冲洗”法的核心价值在于其高效性与安全性。它巧妙地利用了细胞黏附性的差异，以物理方式去除了未分化的iPSCs，将CEC纯度提升至98%，从而极大地降低了移植后潜在的致瘤风险。该方法无需复杂染色或特殊设备，无细胞毒性，成本低廉，具有显著的临床转化优势。
在动物模型中，高纯度的iPSC-CECs移植展现出了卓越的治疗效果：能快速促进角膜透明度恢复，减轻水肿，且移植细胞能在宿主角膜内皮长期存活并发挥功能，同时不引发明显的免疫排斥。生物分布分析进一步证实了治疗的安全性，移植细胞基本局限于眼内，无全身性扩散。
该研究也指出了未来的挑战与方向，包括优化移植细胞递送与黏附的策略（如结合生物材料支架）、应对严重CED模型中可能出现的角膜后部纤维化、以及在更大型动物（如非人灵长类）模型中进一步验证疗效与长期安全性。
总而言之，这项研究不仅提供了一种创新、实用、高效的CECs制备方案，更通过严谨的临床前验证，为利用iPSC技术治疗角膜内皮功能障碍乃至其他退行性眼病，铺就了一条通向临床应用的坚实道路。ACE2W.DM14作为在无动物源成分条件下制备的高纯度CECs，尤其展现出作为未来细胞治疗产品的巨大潜力。
