《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：Characterisation of Antisense Oligonucleotides by Ion-Pair Reversed-Phase UHPLC-HRMS: Method development using Design of Experiments
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本刊推荐一篇题为“基于实验设计的离子对反相超高效液相色谱-高分辨质谱法优化：反义寡核苷酸质量控制方法的开发与应用”的研究论文。反义寡核苷酸（ASO）的合成与降解过程复杂，其质量控制面临严峻挑战。本研究以福米韦生（FMV）和托夫森（TFR）为模型化合物，首次采用实验设计（DoE）策略，系统优化了离子对试剂（DIPEA和HFIP）浓度与洗脱梯度斜率等多重因素，成功开发了两种高灵敏、高选择性的IP-RP-UHPLC-HRMS分析方法。该方法可鉴定并定量低至0.1%水平的杂质，为ASO药物质量控制的系统性方法开发提供了范例，符合监管部门对分析方法开发的“质量源于设计”（AQbD）理念要求，对推动寡核苷酸治疗药物的研发与质控具有重要参考价值。
在生物医药的精密战场上，反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides, ASOs）正成为对抗遗传病、肿瘤、炎症及病毒感染性疾病的一类新兴治疗武器。这类经过化学修饰的单链核酸分子，能够像“分子特工”一样，精准结合特定的信使RNA（mRNA），从而抑制致病基因的表达。然而，与“特工”的培养一样，ASO药物的生产过程也极为复杂。它们通过固相合成法制备，过程中的微小偏差或降解，都会产生一系列结构极为相似的“次品”——即产品相关杂质。这些杂质的存在，不仅关乎药物的“纯度”，更直接影响到其“安全性”与“有效性”，使得ASO药物的质量控制（QC）远比小分子药物更具挑战性。传统分析方法往往难以在灵敏度和选择性之间找到最佳平衡，难以全面、准确地描绘出ASO复杂的杂质谱。为了确保患者用药安全，并满足日益严格的监管要求，开发一种通用、灵敏且可靠的ASO杂质分析与表征方法，成为该领域亟待解决的关键问题。
为此，研究人员在《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》上发表了一项研究，旨在为ASO的杂质表征建立一套系统化的分析方法。他们选择了两个具有代表性的ASO药物作为模型化合物：一个是1998年首个获批上市、用于治疗巨细胞病毒视网膜炎的福米韦生（Fomivirsen, FMV），它是一个全硫代磷酸酯（phosphorothioate, PS）修饰的21聚体DNA寡核苷酸；另一个是2023年获批用于治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）的托夫森（Tofersen, TFR），它是一种具有“缺口体”（gapmer）结构、包含2’-甲氧基乙氧基（2’-MOE）修饰的混合RNA-DNA-RNA寡核苷酸。研究的目标是利用离子对反相超高效液相色谱-高分辨质谱（IP-RP-UHPLC-HRMS）联用技术，结合实验设计（Design of Experiments, DoE）这一系统性优化工具，开发出能够同时满足高灵敏度与足够选择性的分析方法，实现对FMV和TFR中低至0.1%水平杂质的检测、鉴定与相对定量。
为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术：首先，建立了以Orbitrap高分辨质谱为核心检测器的IP-RP-UHPLC-HRMS分析平台。其次，采用了系统的“质量源于设计”（Analytical Quality by Design, AQbD）理念指导方法开发，包括明确分析目标概况（ATP）、识别关键方法属性（CMAs）等。在具体优化中，核心是应用了基于响应曲面法（Response Surface Methodology, RSM）的实验设计（DoE），通过Box-Behnken设计，定量评估了离子对试剂N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）浓度、酸性调节剂六氟异丙醇（HFIP）浓度以及洗脱梯度斜率这三个关键因素对色谱峰高、峰宽及杂质间分离度的影响。最后，利用高分辨质谱提供的精确质量数，对检测到的杂质进行了结构鉴定。
3 结果与讨论
3.1 ATP 和 CMAs
研究首先明确了分析目标：建立能够表征FMV和TFR杂质、并实现至少0.2%报告阈值和1.0%鉴定阈值的方法。为此，选定的分析技术是IP-RP-UHPLC-HRMS，并在负离子电喷雾（ESI(-)）模式下运行。关键方法属性（CMAs）包括：基于紫外（UV）检测的主药峰高和峰宽（分别代表灵敏度和峰形），以及基于提取质谱色谱图计算的特异性杂质对之间的分离度（代表选择性）。
3.2 知识管理
在正式进行DoE优化前，研究进行了系统的知识管理和初步筛选实验。
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3.2.1 固定相和流动相：选择了专为寡核苷酸分析设计的Biozen Oligo核-壳C18色谱柱。在流动相筛选中，比较了三乙胺（TEA，弱离子对试剂）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，中等强度）和二丁胺（DBA，强离子对试剂）三种烷基胺，以及HFIP作为酸性调节剂与甲醇作为有机相的组合。
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3.2.2 筛选阶段：通过一系列预实验，主要依据质谱图质量、信号高度和色谱峰形，优化了质谱参数（鞘气、辅助气温度和S-lens电压），并评估了不同离子对试剂的表现。结果表明，DIPEA在FMV和TFR的分析中均能提供最高的质谱信号强度、良好的色谱峰形，且质谱图中无明显加合物离子干扰，因此被选为最佳离子对试剂。最终确定用于两种ASO分析的通用质谱参数为：鞘气60单位，辅助气温度400°C，S-lens电压90V。
3.3 响应曲面法
在选定DIPEA和最佳质谱条件后，研究进入了核心的DoE优化阶段。
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3.3.1 实验域、模型和实验计划的选择：确定了三个关键因素的考察范围：DIPEA浓度（4-10 mM）、HFIP浓度（40-60 mM）和梯度斜率（2.5-4.5% B/min）。采用三因子三水平的Box-Behnken设计，共进行15次实验（含3个中心点），以建立二次多项式模型，关联因素与CMAs响应。
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3.3.2 福米韦生等高线图分析：针对FMV，分析了DIPEA浓度、HFIP浓度和梯度斜率对其主峰高、峰宽及两个特定杂质（Impurity 1和Impurity 2）间分离度的影响。等高线图直观展示了各因素对响应值的效应。例如，较高的HFIP浓度和梯度斜率有利于提高FMV的UV峰高并降低峰宽，而较低的DIPEA浓度和梯度斜率则有利于提高杂质间的分离度。
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3.3.3 托夫森等高线图分析：对TFR进行了类似分析，考察的响应包括TFR主峰高、峰宽，以及TFR杂质1/杂质2、杂质2/杂质3之间的分离度。分析发现，梯度斜率对提高TFR的UV峰高和改善峰形（降低峰宽）具有最显著的正面效应，而HFIP浓度和DIPEA浓度则对特定杂质对的分离度有重要影响。
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3.3.4 最佳区域图和优化方法条件：将各个响应的预测值叠加，生成了“最佳区域图”（Sweet Spot Plot），该区域代表了能同时满足所有预设响应目标（如FMV峰高>275计数，杂质分离度>0.25等）的实验条件组合。通过此图，研究人员为FMV和TFR分别确定了最优化的色谱条件：对于FMV，为4 mM DIPEA，58 mM HFIP，梯度斜率3.7% B/min；对于TFR，为7 mM DIPEA，52 mM HFIP，梯度斜率4.5% B/min。验证实验表明，预测值与实测值吻合良好。
应用优化条件进行分析，得到了FMV和TFR及其杂质的高分辨提取质谱色谱图，清晰展示了主药峰与多个杂质峰。
3.4 杂质表征
利用优化的方法，研究人员成功对FMV和TFR样品中的杂质进行了全面表征。
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3.4.1 福米韦生杂质：在FMV中检测并鉴定出4个含量高于0.1%的杂质。这些杂质包括缺失一个脱氧核糖-胸腺嘧啶硫代磷酸酯（sTd）的n-1缺失序列、一个硫代磷酸酯转变为磷酸酯的修饰杂质，以及另外两个缺失不同核苷酸的n-1和n-2缺失序列。所有鉴定均基于与主药精确质量数的差异。
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3.4.2 托夫森杂质：在TFR中，共检测到15个含量高于0.1%的杂质，其中13个得到了明确鉴定。鉴定出的杂质类型非常多样，包括多种不同长度的缺失序列（短序列， shortmers）、硫代磷酸酯到磷酸酯的转变，以及一个因鸟嘌呤（G）不完全去保护而产生的异丁酰基加合物杂质。这充分展示了所开发方法对复杂杂质谱的强大解析能力。
4 结论与意义
本研究通过系统性地应用实验设计（DoE），成功开发并优化了两种用于反义寡核苷酸（ASO）福米韦生（FMV）和托夫森（TFR）杂质表征的离子对反相超高效液相色谱-高分辨质谱（IP-RP-UHPLC-HRMS）分析方法。研究不仅证明了DoE是实现ASO分析方法灵敏度与选择性之间最佳平衡的有效工具，能够为特定类型的寡核苷酸和离子对试剂“量身定制”最优条件，而且所建立的方法能够可靠地检测、鉴定并相对定量含量低至约0.1%的杂质。
这项工作的意义深远。首先，它为ASO这类重要治疗药物的质量控制提供了一套经过系统优化、可靠且灵敏的分析解决方案。其次，研究完整展示了“分析质量源于设计”（AQbD）理念在复杂生物分析方法开发中的实际应用流程，包括从分析目标确定、知识管理、实验设计优化到最终方法建立的各个环节。这为遵循日益严格的药品监管要求（如ICH相关指南）提供了范例。最后，该研究响应了寡核苷酸分析领域对更多系统性方法开发案例的呼吁，通过具体实践证明了DoE和AQbD在应对ASO复杂杂质分析挑战中的巨大价值，为未来开发更通用、更高效的寡核苷酸药物分析平台奠定了基础，推动了该领域分析技术的规范化与标准化进程。
