《Materials Today Bio》：Cholesterol Analogs Modulate Lipid Nanoparticle Performance for mRNA Delivery after Lyophilization and Enable Ocular Disease Therapy
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胆固醇是维持mRNA脂质纳米粒(LNP)结构完整性和功能的关键组分，但其类似物在冻干过程中对LNP性能的影响及器官特异性递送效果尚不明确。研究人员系统探究了C24-烷基植物甾醇（β-谷甾醇、岩藻甾醇、菜油甾醇、豆甾烷醇）对mRNA-LNP在冻干前后的形态、稳定性、转染效率及体内分布的影响。研究发现，含β-谷甾醇的新鲜制剂在多数细胞系中转染效率最高，而含豆甾烷醇的制剂在冻干后性能更优。体内实验表明，与胆固醇对照组相比，含β-谷甾醇的ALC-0315基LNP及含岩藻甾醇的MC3基LNP在靶器官中产生了更强的生物发光信号。更重要的是，递送MERTK mRNA的β-谷甾醇-LNP在视网膜变性大鼠模型中显著恢复了视觉功能。该研究揭示了胆固醇类似物细微的结构修饰如何影响mRNA-LNP的治疗效果，为合理设计下一代基因递送系统，特别是用于眼部基因治疗，提供了新思路。
在生物医药领域，信使RNA（mRNA）疗法正掀起一场革命，从新冠疫苗到各类遗传性疾病治疗，其潜力巨大。然而，如何将脆弱且庞大的mRNA分子安全、高效地递送到人体特定部位的细胞中，始终是横亘在科学家面前的一大挑战。脂质纳米粒（Lipo Nanoparticles, LNPs）是目前最主流的mRNA递送载体，它就像一个微小的“快递包裹”，将mRNA保护起来并运送进细胞。这个“包裹”由多种脂质成分精巧组装而成，其中胆固醇（Cholesterol, Chol）扮演着不可或缺的“结构骨架”角色，对维持LNP的稳定性和促进其与细胞膜融合至关重要。
以往的研究发现，用自然界中存在的C24-烷基植物甾醇（即胆固醇的类似物，如β-谷甾醇、岩藻甾醇等）替代传统胆固醇，能在特定细胞（如HeLa细胞）中显著提升基因转染效率。这似乎打开了一扇优化LNP性能的新窗口。但随之而来的是一系列悬而未决的问题：这些胆固醇类似物对LNP的影响是否具有普适性？它们在不同器官来源的细胞中表现如何？在实际应用中，mRNA药物常常需要冻干（lyophilization，即冷冻干燥）以长期保存，这些植物甾醇能否帮助LNP经受住冻干的严酷考验，在复溶后依然保持高效？更重要的是，基于这些优化LNP的mRNA疗法，能否在真实的疾病模型，特别是目前递送难度大、治疗需求迫切的眼睛疾病中，展现出治疗潜力？此前的研究尚未给出答案。
为了回答这些问题，一支来自温州医科大学眼视光学院的研究团队开展了一项系统而深入的研究。他们的研究成果发表在了《Materials Today Bio》期刊上。研究团队系统探究了四种天然C24-烷基植物甾醇——β-谷甾醇（β-Sitosterol, Sito）、岩藻甾醇（Fucosterol, Fuco）、菜油甾醇（Campesterol, Camp）和豆甾烷醇（Stigmastanol, Stig）——对mRNA-LNP性能的全面影响。他们不仅比较了这些LNP在冻干前后的物理化学性质（如粒径、形态、包封率）和在多种人体器官来源细胞系（如肺、肝、结肠、眼、神经元细胞）中的转染效率，还深入评估了它们在活体小鼠体内的分布特性，以及通过视网膜下注射在眼部组织的递送效果。最终，他们挑选出性能最优的LNP配方，在一类患有遗传性视网膜变性（由MERTK基因突变导致）的皇家外科学院大鼠（RCS rats）模型中，验证了其通过递送MERTK mRNA来恢复视觉功能的治疗潜力。
为开展这项多维度研究，作者运用了几个关键的技术方法。首先，他们采用微流控或移液器混合法制备了包含不同离子化脂质（MC3或ALC-0315）和不同胆固醇类似物的mRNA-LNP。其次，利用动态光散射、透射电镜和核糖核酸定量检测试剂盒（Quant-it RiboGreen Assay kits）系统表征了LNP冻干前后的粒径、多分散指数、Zeta电位、形态和包封率。第三，通过流式细胞术和荧光显微镜，全面评估了LNP在多种人源细胞系（如HEK-293T、HeLa、A549、ARPE-19等）中的转染效率。第四，利用活体成像系统（IVIS）分析了经静脉注射的荧光素酶mRNA-LNP在小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾、眼）中的生物分布。最后，通过视网膜下注射技术，将报告基因或治疗性（MERTK）mRNA-LNP递送至C57BL/6J小鼠或RCS大鼠眼部，并结合光学相干断层扫描、视网膜电图、免疫荧光染色和免疫印迹等技术，评估了其在眼内的递送效率、治疗效应及安全性。研究中使用的RCS大鼠来源于北京维通利华实验动物技术有限公司。
研究结果
3.1. 天然C24-烷基胆固醇类似物的修饰调控了mRNA-LNP在冻干前后的结构和形态
研究显示，用植物甾醇替代胆固醇，显著影响了mRNA-LNP的物理化学性质。在冻干前，所有含有植物甾醇的ALC-0315基LNP均能形成规则的纳米颗粒，但粒径和分散度因甾醇种类而异。冻干并复溶后，所有LNP的粒径均增大，包封率大幅下降，表明冻干过程导致了纳米颗粒结构的改变和不稳定。其中，含岩藻甾醇的LNP变化最为剧烈，平均粒径从111纳米激增至557纳米，且分散度极高，表明其结构在冻干压力下极度不稳定。相反，含豆甾烷醇的LNP粒径变化最小，表现出相对较好的冻干稳定性。毛细管凝胶电泳分析证实，冻干后mRNA本身完整性保持良好，包封率下降主要归因于纳米颗粒结构的解体和聚集，而非mRNA降解。
3.2. mRNA-LNP中的胆固醇类似物和离子化脂质对多种器官来源细胞系转染效率的影响
研究人员在七种不同器官来源的细胞系中全面测试了LNP的转染性能。总体而言，无论使用哪种胆固醇类似物，基于ALC-0315的LNP通常比基于MC3的LNP表现出更优的转染性能。在冻干前，含有β-谷甾醇的LNP在大多数测试细胞系（如HeLa、HepG2、Colo205、A549）中表现出最高的转染效率，这与之前的部分研究一致。然而，在冻干复溶后，情况发生了有趣的变化：含有豆甾烷醇的LNP在多个细胞系（如HepG2、Colo205、ARPE-19）中转染效率最高。这表明胆固醇类似物的性能表现具有上下文依赖性，冻干处理能显著改变其相对优劣。
3.3. 含有不同胆固醇类似物和离子化脂质的mRNA-LNP的体内分布
静脉注射后，所有LNP制剂主要分布在肝脏和脾脏。然而，特定的胆固醇类似物与离子化脂质组合能改变其器官靶向性。研究发现，新鲜制备的、含岩藻甾醇的MC3基LNP在肝脏中产生最强的生物发光信号；而冻干复溶后，该配方还能在肺部产生显著的信号，显示出潜在的肺部靶向递送能力。另一方面，无论是新鲜制备还是冻干后，含β-谷甾醇的ALC-0315基LNP在肺部产生的信号均显著强于胆固醇对照组。这表明，通过精心选择胆固醇类似物和离子化脂质组合，可以调节LNP的体内分布，实现一定的器官靶向性。
3.4. 设计的（mCherry）mRNA-LNP制剂视网膜下注射后的视网膜分布
为了评估局部递送效果，研究将不同配方的mRNA-LNP通过视网膜下注射递送至小鼠眼部。结果显示，在全身递送中表现优异的含β-谷甾醇的ALC-0315基LNP，在视网膜局部也实现了强效的mCherry报告基因表达，信号主要位于外核层和视网膜色素上皮层。含岩藻甾醇的ALC-0315基LNP也表现出色。重要的是，免疫荧光染色显示，含β-谷甾醇的LNP引起的视网膜小胶质细胞和星形胶质细胞激活（免疫反应指标）最轻微，表明其具有良好的生物相容性。而含岩藻甾醇的LNP，尤其是MC3基的配方，则引发了更明显的炎症反应。综合递送效率和安全性，含β-谷甾醇的ALC-0315基LNP被选为后续治疗研究的最佳候选。
3.5. 封装MERTK蛋白编码mRNA的最佳LNP治疗视网膜变性效果的体内验证
在最终的治疗验证中，研究团队使用筛选出的最优配方——含β-谷甾醇的ALC-0315基LNP，封装能表达MERTK蛋白的mRNA，通过视网膜下注射治疗患有MERTK基因突变导致的视网膜变性的RCS大鼠。结果表明，治疗组大鼠在注射3周后，其视网膜电图（ERG）的b波振幅（反映视觉功能的关键指标）在多个光刺激强度下均显著高于未治疗组和胆固醇-LNP治疗组，表明视觉功能得到恢复。免疫荧光染色进一步证实，在β-谷甾醇-LNP治疗组大鼠的视网膜中，可检测到MERTK蛋白的成功表达，且持续至注射后4周，而未治疗组和胆固醇-LNP组则无法检测到。组织学分析和炎症标记物染色显示，该治疗方案未引起可检测的视网膜结构毒性或显著炎症反应。
研究结论与意义
该研究系统揭示了胆固醇类似物这一此前未被充分重视的LNP组分，在调控纳米颗粒性能方面的关键作用。研究证实，用特定的植物甾醇（如β-谷甾醇、豆甾烷醇、岩藻甾醇）替代传统胆固醇，不仅能影响LNP的基础物理化学性质，更能显著改变其在冻干稳定性、细胞类型特异性转染效率、体内器官靶向性以及局部组织免疫反应等多个维度的表现。
研究的结论具有多重重要意义：首先，它明确了“最优”胆固醇类似物的选择高度依赖于应用场景（如是否冻干、靶向何种细胞或器官）。例如，β-谷甾醇适用于新鲜制备且需在多数细胞中高效转染的LNP，而豆甾烷醇则在冻干后配方中表现更稳定、高效。其次，研究发现了具有潜在靶向价值的特定组合：岩藻甾醇与MC3离子化脂质组合的LNP，在冻干后显示出向肺部富集的倾向，为开发肺部靶向的mRNA疫苗或疗法提供了新思路。最后，也是最具转化价值的一点，该研究首次在动物模型中证明，基于植物甾醇（β-谷甾醇）优化的LNP能够通过递送MERTK mRNA，成功治疗遗传性视网膜变性，并显著恢复视觉功能。这为眼部基因治疗提供了一种非整合、可重复给药且具有潜在优越递送效率的mRNA-LNP新策略，绕过了目前腺相关病毒载体可能存在的免疫原性和载荷限制等问题。
总之，这项工作超越了仅关注离子化脂质优化的常规思路，深入挖掘了胆固醇类似物这一“结构元件”的巨大潜力，为理性设计下一代具有更优稳定性、靶向性和治疗效力的mRNA-LNP递送系统提供了重要的科学依据和实用的配方线索。
