区分家养绵羊与欧洲摩弗伦羊的新工具：178 bp D-loop片段（OvisCR）在食肉动物食性元条形码研究中的应用

《Metabarcoding & Metagenomics》：A 178 bp diagnostic D-loop fragment (OvisCR) to discriminate domestic sheep ( Ovis aries) and European mouflon ( Ovis musimon) in diet metabarcoding studies

本研究针对食肉动物食性元条形码（metabarcoding）分析中，家养绵羊（Ovis aries）与欧洲摩弗伦羊（Ovis musimon）因遗传高度相似而难以区分的难题，开发并验证了一个178 bp的线粒体D-loop诊断性片段（OvisCR）。该片段包含43个SNP，可有效区分两种羊的单倍型，应用于灰狼（Canis lupus）粪便样本分析时，成功对超过81%的检出样本实现了物种级鉴定。此标记为精确评估捕食者对家畜与野生有蹄类的捕食压力、支持生物多样性保护与冲突管理策略提供了强有力的分子工具。

　　

在欧洲的荒野与牧场交织的图景中，灰狼（Canis lupus）的回归是生态恢复的成功故事，但也带来了新挑战。随着狼群重新在人类主导的景观中定居，它们与畜牧业，特别是养羊业之间的冲突日益加剧。准确了解灰狼究竟捕食了多少家养牲畜，对于制定有效的管理与保护策略至关重要。传统的食性分析方法存在诸多偏差，而新兴的DNA元条形码（DNA metabarcoding）技术通过高通量测序食性样本中的短DNA片段，能够更全面、精确地揭示捕食者的食谱。然而，一个棘手的技术瓶颈横亘在生态学家面前：如何区分遗传上极为相似的家养绵羊（Ovis aries）和野生欧洲摩弗伦羊（Ovis musimon）？这两种羊经常在同一区域共存，但使用常见的线粒体标记（如12S rRNA或细胞色素b基因）时，由于变异不足，无法进行物种级鉴定。这种混淆可能导致对灰狼捕食家畜比例的错误估计，进而影响野生动物保护政策和人兽冲突管理决策的准确性。

为了攻克这一难题，由Agathe Pirog等人领导的研究团队开展了一项研究，旨在开发一种能够可靠区分这两种Ovis物种的新型分子标记。他们的研究成果最终发表在《Metabarcoding》期刊上。

为开展此项研究，研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：首先，从法国阿尔卑斯山地区采集了家养绵羊和欧洲摩弗伦羊的参考样本，通过桑格测序获得了完整的线粒体D-loop区序列，以筛选诊断性片段。其次，利用从同一地区收集的、已知含有Ovis猎物的灰狼粪便样本进行验证。在实验室流程中，研究人员并行扩增了通用的12S rRNA基因片段和新设计的D-loop诊断片段（OvisCR），并在Ion Torrent平台上进行高通量测序。最后，研究采用了两种常用的生物信息学分析流程——基于操作分类单元（OTU）的OBITools和基于扩增子序列变体（ASV）的DADA2，对测序数据进行处理、比对和物种鉴定，以评估新标记的性能和分析流程的影响。

Ovis参考样本分析结果

通过对46只家养绵羊和46只欧洲摩弗伦羊参考样本的完整D-loop区进行测序，研究人员成功鉴定出一个178 bp的片段，并将其命名为OvisCR。该片段包含43个可变位点，能够区分4个摩弗伦羊单倍型和35个绵羊单倍型，且两个物种间没有共享的单倍型。单倍型网络分析显示，大多数单倍型在物种间被至少三个突变位点隔开。研究还发现，家养绵羊的单倍型多样性（Hd = 0.985）远高于欧洲摩弗伦羊（Hd = 0.669），这可能反映了家养物种在人工选择下积累了更高的遗传多样性，而摩弗伦羊则可能受到奠基者效应和基因流限制的影响。

狼粪样本验证结果

研究人员将OvisCR标记应用于115份含有Ovis猎物的灰狼粪便样本。无论使用OBITools还是DADA2分析流程，OvisCR片段均能在绝大多数样本中成功检测到Ovis序列。当设定每个样本中Ovis读取数阈值大于100时，OvisCR能够对超过81%的样本实现物种级鉴定。具体而言，使用OBITools时，102个样本中有83个（81.4%）被鉴定到种；使用DADA2时，105个样本中有91个（86.7%）被鉴定到种。未能鉴定到种的样本通常具有显著较低的测序深度。两种生物信息学流程的结果高度一致，DADA2在低测序深度样本中表现出稍高的物种鉴定率。对照样本（阴性、阳性对照）的分析结果支持对OvisCR数据采用比通用12S标记更宽松的读取数阈值（如10条），这可以在不引入明显错误分配的情况下，提高物种鉴定的灵敏度。

讨论与结论

本研究成功开发并验证了线粒体D-loop区的一个178 bp诊断片段（OvisCR），用于在食肉动物食性元条形码研究中区分家养绵羊和欧洲摩弗伦羊。该标记有效解决了通用元条形码标记分辨率不足的问题。研究发现，OvisCR片段在法国阿尔卑斯山地区的灰狼食性分析中表现稳健，物种级鉴定成功率超过80%。研究还比较了OBITools和DADA2两种生物信息学流程，发现两者在测序深度足够时结论相似，但ASV方法（DADA2）在低深度样本中可能略有优势。

这项研究的意义重大且直接。从保护和管理角度看，准确区分捕食对象是家畜还是野生动物至关重要。捕食家养绵羊是欧洲人狼冲突的核心驱动力，关系到牧民的经济损失和冲突缓解策略；而捕食野生摩弗伦羊则更多涉及游戏动物管理和野生种群动态。将两者混淆可能导致对牲畜损失的错误估计、不当的冲突缓解措施乃至有缺陷的补偿或管控决策。本研究开发的OvisCR标记为此提供了可靠的技术解决方案。此外，该研究为针对其他亲缘关系近、难以区分的物种对开发特异性分子标记提供了方法论范例。需要注意的是，该标记的效力在法国背景下得到验证，将其应用于更广泛的地理区域前，需使用包含当地物种多样性的参考数据集进行先验验证。总之，这项研究为提升食肉动物营养生态学研究的推断能力、支持生物多样性保护与管理策略提供了一个新的、强有力的实用工具。