光交联的有机-无机蛋白水凝胶，内置纳米簇，用于空间生物矿化并促进骨生成

《Nano Today》：Photocrosslinked organic-inorganic protein hydrogel with built-in nanoclusters for spatial biomineralization and enhanced osteogenesis

生物仿生丝绸复合材料水凝胶通过光引发双交联和Ca2+配位实现动态硬化，促进均匀羟基磷灰石矿化，提升刚度达10倍并改善骨再生效果。

　　

作者：马兰天、张梦、郑美丹、沈家伟、于耀军、Kundu Subhas、杨明颖、刘兆明、毛传斌、帅亚军

单位：中国浙江省杭州浙江大学动物科学学院应用生物资源研究所丝绸与丝蛋白新材料重点实验室，邮编310058

摘要

修复复杂的骨缺损（尤其是与矿化障碍相关的缺损）需要具备结构支撑和可控空间矿化形成的材料。受自然界生物矿化过程的启发，我们开发了一种基于丝蛋白的仿生复合材料（BSC）水凝胶，该水凝胶具有“动态硬化”特性，这种特性是通过光触发双重交联以及Ca²⁺配位作用实现的，从而能够在体外促进矿化。该技术的核心是一个有机-无机杂化网络，其中包含了甲基丙烯酸化的丝蛋白（SilMA）、双功能磷酸酯交联剂bis(2-甲基丙烯酰氧乙基)磷酸酯（BMAP）和Ca²⁺。光固化后形成的双交联共价-配位网络能够稳定均匀分布的非晶磷酸钙（ACP）纳米颗粒，并在基质中形成纳米级通道。这些嵌入的纳米颗粒作为成核位点，在模拟的生理条件下促进向类磷灰石（羟基磷灰石）的相变。这种矿化作用提高了水凝胶的硬度（模量从0.033 MPa增加到1.075 MPa），并在7天内形成了均匀矿化的基质。BSC配方兼容数字光刻（DLP）和挤出3D打印技术，可用于制造具有解剖学相关结构的支架。在大鼠颅骨缺损模型中，BSC水凝胶促进了愈合相关的免疫微环境，增强了血管生成，并改善了骨再生效果。总体而言，BSC水凝胶为修复具有挑战性的骨缺损提供了一个基于生物启发的、适合3D打印的平台。

引言

由创伤、肿瘤切除和感染引起的骨缺损在临床上越来越受到关注[1][2]。特别是与骨矿化障碍相关的病例，如骨质疏松症、与年龄相关的骨丢失、低磷酸酶症和X连锁低磷酸血症[3]。在这些病理状态下，固有的矿化过程受到根本性的破坏，导致能量代谢降低、机械完整性受损，最终影响再生效果[3][4]。虽然传统的骨移植替代材料（包括金属、陶瓷和聚合物）通常具有足够的初始强度[5][6]，但它们往往无法生物整合或参与矿化离子的动态代谢，从而限制了其长期效果。

为了解决这一难题，仿生策略主要采取了两种途径：无机相（例如羟基磷灰石颗粒）的物理混合[7]，以及在矿化溶液中孵化的生物矿化[8][9][10][11][12]。尽管混合复合材料可以改善初始的机械性能，但它们常常会出现宏观相分离和界面整合不良的问题，导致颗粒渗出和长期性能不稳定。相反，目前的生物矿化方法可以产生更接近骨组织的羟基磷灰石（HAp）相[13][14]，但矿化通常仅限于支架表面，从而形成异质结构，无法再现天然骨组织的均匀矿化分布。

天然骨矿化是一个由有机和无机成分在分子水平上协同驱动的动态、空间有序的过程。磷酸化蛋白质会捕获Ca²⁺，在纳米限定的水环境中形成非晶磷酸钙（ACP）前体，随后引导其相变为结晶磷灰石[10][15][16]。这种自下而上的、自我更新的离子吸附-成核-重塑循环是骨组织活力和适应能力的本质[17][18]。因此，先进的骨再生生物材料不仅应提供结构支撑，还应具备促进有序矿化的设计特性，以接近天然骨组织中的动态矿化过程。

丝蛋白（SF）因其优异的生物相容性、可调的生物降解性和多样的化学功能而受到关注[19][20][21][22]。其带负电荷的氨基酸可以通过静电作用吸引Ca²⁺[23][24]，而其结晶-非晶相分离形成的纳米限定的空间可以作为HAp成核的模板[25][26][27]。因此，基于SF的系统被广泛用于先进制造和生物矿化[14][28][29][30]。尽管前景广阔，但目前基于SF的系统通常依赖于静态封装和被动矿化方案，无法充分再现生理骨重塑过程中连续且均匀的矿化动态。

为了解决这些限制，我们提出了一种基于分子工程丝蛋白复合水凝胶的仿生策略，该水凝胶能够实现有序的矿化。该设计的核心是一种有机-无机交联生物墨水（OCB），由甲基丙烯酸化的丝蛋白（SilMA）、双功能磷酸酯交联剂bis(2-甲基丙烯酰氧乙基)磷酸酯（BMAP）和Ca²⁺组成。通过Ca²⁺介导的配位作用，该系统能够在水凝胶中均匀形成ACP纳米颗粒，并建立纳米级离子通道网络（图1A）。利用3D打印技术，我们制备了具有模拟骨微环境和缺损几何形状的聚合物化水凝胶（图1B）。嵌入的ACP纳米颗粒作为成核位点，在模拟生理条件下促进逐渐向HAp的相变（图1B）。结果，水凝胶通过持续的矿化重塑表现出矿化成熟特性，并在体外和体内支持血管生成和骨生成（图1C）。通过光触发双重交联和Ca²⁺配位作用实现超分子水平的有机-无机协同，该策略不仅在整个网络中实现了ACP的均匀成核，还克服了传统复合材料中的界面弱点，具备“动态硬化”能力。因此，它为构建体外骨模型和促进体内矿化缺陷区域的再生提供了一个多功能平台。

部分细节

SF溶液的制备

SF溶液的制备遵循了我们之前描述的方法，并进行了一些修改[31]。首先用Na₂CO₃水溶液煮沸脱胶家蚕茧壳，然后将干燥脱胶后的丝纤维溶解在9.3 M LiBr溶液中。所得SF溶液经过过滤、透析、纯化后，储存在4°C下以待进一步修改。

SF的的功能化

SF的甲基丙烯酸化按照先前建立的方案进行[32]，其中使用了GMA（Aladdin）...

有机-无机生物墨水的分子设计与杂交机制

我们设计了一种三元生物墨水，由丝蛋白（SilMA）、双功能磷酸酯交联剂（BMAP）和二价Ca²⁺离子组成，以生成能够实现可控矿化成熟的有机-无机前体（图1A）。为了探究分子间相互作用和组装行为，我们对两种系统进行了分子动力学（MD）模拟：SilMA-BMAP和SilMA-BMAP与Ca²⁺（图1B）。在没有Ca²⁺的情况下，SilMA链呈现相对伸展的构象；引入Ca²⁺后...

讨论

仿生水凝胶支架通过提供定制的结构、化学和机械线索，为改善骨修复提供了新途径[11][43][44]。我们介绍了一种光交联的有机-无机杂化材料（BSC），它将含磷酸基团的BMAP-Ca²⁺配位与甲基丙烯酸化的丝蛋白基质结合在一起。这种生物墨水不仅适用于3D打印，还具有持续的生物矿化特性。分子模拟、显微镜观察和整体分析都证实了这一特性...

结论

总之，本研究介绍了一种光触发型有机-无机杂化水凝胶，它结合了Ca²⁺介导的配位作用和共价的SilMA-BMAP网络，生成了富含ACP的、可3D打印的前体。BSC水凝胶不仅再现了骨组织的结构特性，还促进了均匀的矿化沉积，从而显著提高了机械性能，并在体内促进了血管生成和骨生成。这种基于生物启发的“矿化成熟”...

CRediT作者贡献声明

马兰天：撰写初稿、方法学设计、实验研究、数据分析。 张梦：撰写初稿、数据可视化、结果验证。 郑美丹：资源获取、实验协助。 沈家伟：结果验证、软件应用。 于耀军：方法学设计。 Kundu Subhas：撰写、审稿与编辑、实验监督。 杨明颖：实验监督、资源协调、资金申请。 刘兆明：撰写、审稿与编辑、概念构思。 毛传斌：撰写、审稿与编辑、实验监督。

利益冲突声明

作者声明以下可能的财务利益或个人关系可能构成潜在的利益冲突：帅亚军拥有浙江大学颁发的关于3D打印坚韧丝蛋白支架材料的制备方法和应用的专利。其他作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

我们感谢浙江省自然科学基金（LY22E030004）、中国中医科学院中药健康产业基金会（ZYTS-2025008）、中国博士后科学基金（2023M743064）以及蚕业产业技术体系（CARS-18-ZJ0501）的支持。S.C.K.感谢提供在浙江省丝绸与丝蛋白新材料重点实验室工作的机会。