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本文针对传统多光谱共聚焦显微镜成像速度慢、难以同时获取高分辨率多光谱数据的瓶颈，研究团队开发了一种基于窗口扫描技术的多点多光谱共聚焦显微镜。该系统利用32x32微透镜阵列，在450-650 nm光谱范围内，以1 Hz的实时成像频率同步采集22个光谱通道，实现了对荧光标记样品的高速、高分辨率多光谱成像，为药物筛选和细胞功能研究提供了新的强大工具。
在生物学和医学研究中，窥探微观世界的精细结构至关重要。荧光显微镜技术通过为特定细胞结构“着色”，让我们能够清晰地观察它们的形态与动态。其中，多光谱成像技术尤为强大，它能通过分析样本对不同颜色（波长）光的反应，探测到单一颜色荧光标记无法揭示的细微差异，例如细胞内微环境的pH值变化或不同分子的相互作用。这些光谱上的细微差异是宝贵的“对比剂”，能够帮助科学家识别新药物候选化合物。然而，要实现这种精细观测，高分辨率的光谱探测能力是关键。传统的共聚焦显微镜虽然能提供高空间分辨率的清晰图像，但它是一种逐点扫描的“慢工出细活”技术，获取一幅多光谱图像耗时漫长。现有的高速多点并行成像技术，如转盘共聚焦显微镜，又受限于其光路设计，通常只能通过滤光片选择少数几个波段，难以实现高分辨率、高通量的同步多光谱测量。因此，开发一种能够快速、同时捕捉大量光谱信息的成像平台，成为了生命科学研究中一个亟待解决的技术瓶颈。
为了解决上述问题，研究人员开发并验证了一种创新的多点多光谱共聚焦显微镜。该研究发表在了《Optics》期刊上。为了开展此项研究，作者主要运用了以下几个关键技术方法：1. 基于32x32微透镜阵列(Microlens Array, MLA)和匹配的定制针孔阵列，实现1024个激发焦点的并行生成与共聚焦过滤。2. 采用一对振镜(Galvanometer Scanner)进行样本平面的双向连续扫描(X/Y扫描)，替代传统的步进扫描模式。3. 引入第三振镜(X*扫描器)对经棱镜色散后的荧光光谱条纹进行同步扫描(Synchronized Spectral Sweeping)，将图像传感器所需的原始帧数从N2减少到N，从而将完整图像的采集时间从近2分钟缩短至1秒。4. 通过楔形棱镜进行光谱分离，并在450 nm至650 nm光谱范围内实现22个光谱通道的同时采集。5. 使用固定的植物样本（铃兰，Convallaria Majalis）切片，分别用两种染料（Safranin和Fast Green）以及单种染料（Acridine orange）进行染色，以验证系统的成像性能。6. 利用MATLAB高光谱工具箱进行数据分析，包括主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)以区分不同的光谱组分。
研究结果
3.1 铃兰样本的双染料成像结果
通过成像经Fast Green和Safranin双染色的铃兰样本，系统能够清晰区分两种染料在样本中不同的定位区域。假彩色图像显示了三个具有不同光谱特征的感兴趣区域(Region of Interest, ROI)。光谱曲线分析证实，ROI 2和ROI 3的光谱分别与Fast Green和Safranin的发射光谱相符，而ROI 1在550-600 nm波段显示出独特的光谱特征，验证了系统区分不同荧光团及其微环境差异的能力。
3.2 铃兰样本的单染料成像结果
对仅用Acridine orange单染的铃兰样本成像显示，即便使用单一染料，系统也能探测到因染料结合不同核酸或受局部pH值影响而产生的光谱变化。假彩色图像揭示了光谱性质随染色位置的变化。通过主成分分析，成功分离出两个主要的光谱组分：组分1主要限于500-575 nm范围，而组分2则限于575-650 nm范围，这直接证明了该系统在无需多重标记的情况下解析复杂光谱信息的能力。
结论与讨论
本研究成功开发了一种基于32x32针孔阵列和棱镜光谱仪的多点多光谱共聚焦显微镜。该系统通过光谱扫描方法，实现了在单次曝光中同步采集22个光谱通道的数据，并以1 Hz的实时频率生成多光谱共聚焦图像。这一突破性技术解决了传统多点共聚焦技术在光谱分辨率与成像速度之间的固有矛盾。
其重要意义主要体现在以下几个方面：首先，在技术层面，该设计采用了一种新颖的光学几何结构，利用第三扫描器的光谱扫描将图像采集所需传感器帧数从二次方(N2)降至线性(N)，显著提升了成像速度。与基于多光子激发的先前方法相比，本系统在复用点数上具有高出数个数量级的潜力，为高通量成像奠定了基础。其次，在应用价值上，同步多光谱测量能力对于使用荧光标记（通常具有20-50 nm带宽）的多标记实验和复杂系统研究（如大规模体外药物筛选）极具威力。它能够在单次成像中完成对样品的全光谱分析，避免了为获取不同波段信息而进行的重复曝光，从而最大限度地减少了对活细胞的光毒性和光漂白效应，为活细胞长时间动态观测提供了可能。此外，该技术架构原生兼容新一代图像传感器（如用于荧光寿命成像(FLIM)的sCMOS或SPAD5122传感器），为开发首台1 Hz多点多光谱共聚焦FLIM显微镜铺平了道路，有望在低光和时间分辨测量领域实现增强型光谱分辨测量。
当然，该系统仍有优化空间。例如，当前使用的消色差透镜在超大视场下难以保证衍射极限性能，未来采用复消色差双远心扫描透镜可改善此问题。针孔直径的选择需要在光谱范围、共聚焦切片厚度和图像对比度之间进行权衡。通过调整发射臂的放大倍率，有望在满足采样要求的前提下将复用点数提升至4096，使系统性能受限于视场而非传感器。总体而言，这项研究为快速多光谱成像平台提供了一个行之有效的概念验证，其高达1024点的复用能力在多光谱共聚焦成像领域前所未有，有望对药物发现、基础细胞生物学研究等多个领域产生显著的积极影响。
