揭示RAWUL结构域在PRC1转录抑制中的关键作用：基于CRISPR编辑AtRING1的研究

《The Plant Journal》：CRISPR gene editing of AtRING1 unravels a critical role of RAWUL domain in PRC1 repression of transcription

本研究通过CRISPR/Cas9技术对拟南芥AtRING1A基因进行编辑，在atring1b-1背景下构建了N端终止突变体（atring1ko）和缺失C端RAWUL结构域的两个突变体（atring1ΔC-terminal）。研究发现，atring1ko表现出最强的功能缺失表型，证实AtRING1是细胞分化的关键因子；而RAWUL结构域的缺失仅导致轻微发育缺陷，表明其可精细调控PRC1活性。分子分析进一步揭示，RAWUL结构域是高效沉积H2A单泛素化（H2Aub1）所必需的，并能以位点特异性方式影响PRC2介导的H3K27me3修饰。该工作为理解植物PRC1复合体的组装与功能提供了新见解，并支持PRC1可促进PRC2在表观遗传沉默中发挥作用的模型。

在生命的发展蓝图中，基因并非时刻都在高声表达，许多时候需要被精确地“沉默”，以确保细胞在正确的时间、正确的地点执行正确的功能。执行这种“沉默”指令的关键角色之一是多梳群蛋白。它们如同细胞内的“基因开关管理员”，主要通过形成多梳抑制复合体1和2来工作。其中，PRC2负责沉积H3K27me3（组蛋白H3第27位赖氨酸的三甲基化）这一经典的抑制标记，其机制在动植物中相对明确。然而，它的搭档PRC1在植物中却仍笼罩在神秘面纱之下。PRC1的核心功能被认为是催化H2A的单泛素化，但它的具体组装方式、各个部件如何协同工作，尤其是其核心组分AtRING1蛋白上不同结构域的具体功能，仍然知之甚少。以往的研究多依赖于T-DNA插入突变体，这些突变体可能无法完全敲除基因功能，导致对AtRING1真实作用的评估可能存在偏差。为了更精确地解析AtRING1的功能，特别是其C端RAWUL结构域的作用，并厘清PRC1与PRC2两个复合体在基因沉默中是先后接力还是相互影响的复杂关系，研究人员开展了一项深入的研究。相关成果发表在植物科学知名期刊《The Plant Journal》上。

为开展本研究，作者主要运用了以下几项关键技术：首先，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在拟南芥atring1b-1突变体背景下，对AtRING1A基因的不同区域进行精准编辑，构建了包括完全敲除和特定结构域缺失在内的系列突变体。其次，通过表型观察、石蜡切片、脂肪红染色等手段系统分析了突变体的生长发育缺陷。第三，采用蛋白质印迹和染色质免疫共沉淀技术，检测了全球及特定基因位点的组蛋白修饰水平变化。第四，通过定量逆转录聚合酶链反应分析了关键发育基因的表达变化。

研究结果

AtRING1敲除突变体表现为胚胎致死性和未分化的胚后生长

研究人员设计sgRNA1靶向AtRING1A基因第一个外显子的5‘端，通过CRISPR/Cas9技术在atring1b-1背景下成功获得了纯合的atring1^ko突变体。该突变体在第44位碱基处插入了一个腺嘌呤，导致移码和提前终止密码子，完全丧失了RING和RAWUL结构域。与之前T-DNA插入突变体atring1ab还能产生少量种子不同，atring1^ko突变体的地上部分完全呈现为一团未分化的绿色愈伤组织状结构，无法形成任何可识别的器官，证明了AtRING1在细胞分化中的绝对核心作用。

C端破坏导致AtRING1A产生轻微的发育缺陷

为了特异性研究C端RAWUL结构域的功能，研究者设计了sgRNA2和sgRNA3分别靶向RING与RAWUL结构域之间的区域以及RAWUL结构域自身，获得了两个缺失RAWUL结构域的纯合突变体atring1^{ΔC-terminal-1}和atring1^{ΔC-terminal-2}。与完全敲除突变体的严重表型相反，这两个缺失RAWUL结构域的突变体仅表现出轻微的发育缺陷，如下卷曲的叶片、略微增加的 floral organ 数目以及部分子房发育异常，但植株能正常完成生命周期并保持可育。这表明RAWUL结构域对AtRING1的功能起重要的“微调”作用，而非绝对必需。

AtRING1的C端破坏略微延迟萌发、加速营养阶段转变并推迟开花时间

对atring1^{ΔC-terminal-2}的代表性分析显示，突变体种子萌发略微延迟。在短日照条件下，其具有更少的无毛（幼叶特征）叶片，表明营养阶段提前转换。然而，无论在长日照还是短日照条件下，其开花时间均显著晚于野生型。这说明RAWUL结构域的缺失导致了发育时相调控的紊乱，营养成熟提前而生殖转换推迟。

atring1突变体中H2Aub1水平受到影响

蛋白质印迹分析显示，在完全敲除突变体atring1^ko中，H2Aub1的全球水平几乎完全消失。而在两个缺失RAWUL结构域的突变体中，H2Aub1水平也显著降低，但降低程度不如完全敲除突变体剧烈。这表明RAWUL结构域对于PRC1发挥完全的E3连接酶活性至关重要，但仅包含RING结构域的截短蛋白仍保留了部分催化功能。同时，这些突变体的全球H3K27me3水平并未发生显著变化。

atring1突变体中靶基因的转录抑制

定量PCR分析表明，在atring1^{ΔC-terminal-2}突变体中，一系列已知的PcG靶基因（如与分生组织身份相关的CUC1、CUC2，与开花抑制相关的FLC、MAF4/5等）发生了选择性的、中等程度的去抑制。染色质免疫共沉淀分析进一步证实，在这些靶基因位点，H2Aub1的富集显著减少。有趣的是，H3K27me3的富集在部分位点（如CUC1、MAF4、MAF5）也显著降低，但在另一些位点（如CUC2、DOG1、FLC）却保持不变。这说明RAWUL结构域对于高效的H2Aub1沉积是必需的，并且它以位点特异性的方式影响PRC2介导的H3K27me3修饰。

研究结论与讨论

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了新型的AtRING1A突变体，精细解析了其不同结构域的功能。完全敲除突变体atring1^ko表现出与atbmi1突变体类似的严重未分化表型，并完全丧失了H2Aub1，这证实了AtRING1与AtBMI1同样对于形成有功能的PRC1复合体、维持发育身份至关重要。而对RAWUL结构域缺失突变体的分析则揭示，该结构域虽非生存所必需，但对PRC1的E3连接酶活性起关键的“微调”作用，是高效沉积H2Aub1所必需的。

更为重要的是，本研究为理解植物中PRC1与PRC2的相互作用关系提供了新见解。研究结果表明，PRC1介导的H2Aub1沉积通常先于PRC2介导的H3K27me3沉积。RAWUL结构域以一种位点特异性的方式影响H3K27me3的水平，这意味着PRC1可以通过RAWUL结构域依赖性或非依赖性的不同机制来促进PRC2的招募或活性。研究人员提出了一个模型：在部分位点，PRC2可能通过LHP1等蛋白与AtRING1的RAWUL结构域相互作用而被招募；而在另一些位点，PRC2的招募则不依赖于RAWUL结构域。这种模块化和上下文依赖的关系，挑战了PRC2始终严格上游于PRC1的传统线性模型。

综上所述，这项研究不仅明确了AtRING1蛋白中RAWUL结构域在调控PRC1活性和植物发育中的具体作用，还深化了对PRC1与PRC2这两个核心表观遗传复合体在植物中如何协同工作的理解，为未来操纵作物表观遗传状态以改良农艺性状提供了重要的理论基础。