Spink1 促进 Kras 突变胰腺腺泡细胞的存活

《Pancreatology》：Spink1 Promotes the Survival of Kras-Mutant Pancreatic Acinar Cells

胰腺特异性Spink1基因敲除引发慢性胰腺炎样病变并加速Kras突变诱导的PanIN形成，提示Spink1可能通过调控胰蛋白酶活性参与胰腺癌早期进程，靶向Spink1或可成为预防策略。

　　

林英弘（Hidehiro Hayashi）|滨田信（Shin Hamada）|松本亮太郎（Ryotaro Matsumoto）|泷川哲也（Tetsuya Takikawa）|徐燕（Yan Xu）|聂仁（Ren Jie）|中辻仁美（Hitomi Nakasuji）|安倍敏明（Toshiaki Abe）|菊田和弘（Kazuhiro Kikuta）|本桥保纯（Hozumi Motohashi）|大村亮（Masaki Ohmuraya）|正宗淳（Atsushi Masamune）

东北大学医学研究生院消化内科，日本仙台市青叶区清良町1-1，邮编980-8574

摘要

背景

由于胰腺癌具有很强的治疗抵抗性和难以早期发现的特点，它仍然是最难治疗的恶性肿瘤之一。先前的研究表明，胰腺炎症可能促进癌变。相反，控制胰蛋白酶活性的调节机制与胰腺炎的易感性密切相关。在遗传性胰腺炎中，已经发现了导致胰蛋白酶持续活性的基因变异，从而促进了蛋白酶的激活。丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型（SPINK1）作为胰蛋白酶活性的内源性抑制剂。小鼠中删除Spink1基因会导致严重的胰腺萎缩和出生后的早期死亡。除了在胰腺炎中的作用外，SPINK1还被报道可以通过支持细胞存活来促进多种类型的肿瘤发展。

方法

在本研究中，我们调查了胰腺特异性删除Spink1基因是否会影响蓝斑肽（caerulein）诱导的胰腺炎后的炎症和纤维化。我们还研究了胰腺特异性删除Spink1基因是否会影响小鼠中Kras突变驱动的癌变过程。

结果

胰腺中Spink1基因的缺失引发了与慢性胰腺炎一致的组织学变化，并伴有肌肉萎缩。此外，Spink1基因缺失与突变Kras基因的表达共同作用会导致由于严重胰腺萎缩而引起的早期死亡。Spink1基因的杂合缺失也减缓了由突变Kras基因引起的胰腺上皮内肿瘤（PanIN）的发展。

结论

这些发现表明，SPINK1在胰腺癌的早期阶段起着支持作用。针对SPINK1可能代表了一种新的预防策略，可以消除Kras突变细胞并抑制胰腺癌的起始。

引言

在美国，胰腺癌目前是男性癌症相关死亡的第四大原因，女性中排名第三¹。五年生存率约为10%²，这反映了这种恶性肿瘤的难以治疗性。疾病的快速进展、对化疗的抵抗以及早期检测的挑战继续阻碍着临床疗效的提高³。大多数胰腺癌携带持续活跃的KRAS突变，而在小鼠中胰腺特异性表达突变Kras基因可以再现PanIN（一种已建立的癌前病变）的发展⁴。然而，仅表达突变Kras基因不足以诱导侵袭性胰腺癌；额外的基因改变（如TP53突变）已被证明可以促进肿瘤进展⁵。腺泡细胞向导管细胞转化的过程（ADM）可以由炎症或KRAS突变触发⁶。尽管如此，在ADM和PanIN形成之前的各种应激条件下，调控腺泡细胞存活的分子决定因素仍然很大程度上未被探索。

导致遗传性胰腺炎的致病基因变异PRSS1 p.R122H于1996年首次被发现⁷。该突变消除了阳离子胰蛋白酶原中的胰蛋白酶敏感的自溶位点，从而导致胰蛋白酶持续活性。在这一发现之后，还发现胰蛋白酶的内源性抑制剂SPINK1的变异也与慢性胰腺炎有关^{8, 9, 10}。虽然遗传性胰腺炎仅占慢性胰腺炎病例的一小部分（日本全国流行病学调查显示¹¹），但疾病的长期持续性和生活质量的大幅下降仍然是主要的临床问题。这些发现强调了维持适当的胰腺内胰蛋白酶调节以防止胰腺炎的重要性。在小鼠中全球性删除Spink1基因会导致由于严重生长迟缓和广泛的胰腺实质丢失而引起的出生后早期死亡¹²。Spink1基因缺陷小鼠的腺泡细胞会经历自噬性细胞死亡，从而导致组织再生受损。慢性胰腺炎本身是胰腺癌的一个已知风险因素，在遗传性胰腺炎中，疾病发病年龄较早，累积风险尤其高¹³。此外，在Kras突变小鼠模型中已经证明了胰腺炎的促癌作用，其中蓝斑肽处理诱导的胰腺炎显著加速了胰腺癌的发生¹⁴。

除了在调节胰蛋白酶活性中的作用外，SPINK1还被证明具有促肿瘤作用。例如，在结直肠癌细胞中敲低SPINK1可以抑制细胞增殖、侵袭以及在软琼脂中的非锚定生长¹⁵。在舌鳞状细胞癌中，高水平的SPINK1表达与较差的整体生存率相关¹⁶。在肝细胞癌中，SPINK1的过表达增强了自我更新能力和化学抗性——这些都是癌干细胞的关键特征¹⁷。此外，SPINK1是缺氧诱导因子的转录靶标；肿瘤缺氧会上调其表达并保护癌细胞免受氧化应激¹⁸。总的来说，这些发现表明SPINK1在胰腺癌中也可能发挥促肿瘤作用。由Spink1缺失引起的胰腺炎症可能反而会促进癌变。

为了解决这些问题，我们进行了本研究。首先，我们检查了胰腺特异性删除Spink1基因对自发性和蓝斑肽诱导的胰腺炎模型的影响。接下来，我们将Spink1基因缺失引入表达持续活跃突变Kras（G12D）的小鼠，并评估了由此产生的组织学变化和PanIN的形成。

方法部分

伦理。所有动物实验均按照东北大学动物实验及相关活动的规定进行（批准编号2018MdLMO-182-11和2024MdA-014-05），基于国家研究委员会发布的《实验室动物护理和使用指南》。小鼠可以自由获取水和标准饲料。

材料蓝斑肽从Wako（日本大阪）购买。二氨基联苯胺（DAB）从Dojindo（日本熊本）获得。

胰腺特异性Spink1基因缺失导致慢性胰腺炎

如图1A所示，loxP序列被插入Spink1基因的第1和第3内含子中。将Spink1^flox/flox小鼠与Pdx1-Cre小鼠杂交，生成Pdx1-Cre::Spink1^flox/flox（SChm）和Pdx1-Cre::Spink1^flox/+（SCht）小鼠。我们进行了定量RT-PCR（qRT-PCR）和免疫组化分析，以评估Spink1^flox/flox对照小鼠和SChm小鼠中的Spink1表达。我们的qRT-PCR分析显示，与

讨论

本研究表明，小鼠中胰腺特异性删除Spink1基因会诱导类似慢性胰腺炎的组织学变化，包括腺泡细胞丢失和纤维化。与导致大约14天龄时早期死亡的全局性Spink1基因敲除不同¹²，胰腺特异性删除的小鼠是存活的，并且可以进行长期观察。这些小鼠的体重增长也比对照组小鼠少。血浆胰蛋白酶活性没有

资助

本研究部分得到了JSPS KAKENHI（25K02632、23K07452和23K15062）的支持

披露

作者声明没有利益冲突。

伦理声明和患者同意

本研究中未包含任何患者来源的样本和信息。

致谢

我们感谢东北大学医院的生物医学研究部门提供的实验和技术支持。用于本研究的Spink1小鼠品系是从KOMP Repository（www.komp.org）获得的ES细胞克隆中创建的，并由Wellcome Trust Sanger Institute生成。