基于结构的筛选方法以及对多酚类物质表没食子儿茶素-3-没食子酸和迷迭香酸在A375黑色素瘤细胞中的体外细胞毒性评估

《Pharmacological Research - Natural Products》：Structure-Based Screening and In Vitro Cytotoxic Evaluation of Polyphenols Epigallocatechin-3-gallate and Rosmarinic Acid in A375 Melanoma Cells

本研究通过网络药理学、分子对接和动态模拟，揭示了EGCG和RA作为多靶点抑制剂的潜力，证实其抑制BRAF/MEK信号通路的能力，并发现RA在细胞毒性方面优于达拉非尼。结果为开发新型多靶点抗黑色素瘤药物提供了依据。

　　

拉胡尔·科利（Rahul Koli）|V.S. 曼努尔（V.S. Mannur）|尚卡尔·加尔杰（Shankar Gharge）|萨钦·古达西（Sachin Gudasi）

印度卡纳塔克邦贝拉加维市尼赫鲁纳加尔-590010，KLE高等教育和研究学院，KLE药学院药物质量保证系

摘要

尽管BRAF和MEK细胞内激酶抑制剂取得了进展，但黑色素瘤仍然是一个重大的全球健康挑战，这些抑制剂的疗效常常受到耐药性和毒性的限制。本研究的目的是探讨植物来源的多酚作为BRAF/MEK信号通路多靶点抑制剂的潜力，以用于黑色素瘤的治疗。网络药理学分析确定MAPK、PI3K-Akt和Ras通路是黑色素瘤进展中的关键节点。表没食子儿茶素-3-没食子酸（EGCG）和迷迭香酸（RA）与多个致癌靶点表现出强烈的相互作用。分子对接实验显示EGCG能够与BRAF（CYS532、ASP594）结合，而RA能够与MEK（MET146、SER150、ALA76）结合，分子动力学模拟进一步证实了这种结合的稳定性。高效液相色谱（HPLC）验证了化合物的真实性，量子化学分析突出了RA的优异反应性和稳定性。这两种多酚均符合Lipinski的标准，并显示出可接受的药代动力学特性。在A375黑色素瘤细胞上的体外 MTT实验表明，它们具有浓度依赖性的细胞毒性，其中RA在较高浓度下的效力优于EGCG，甚至超过了达布法尼布（50 μM）。总体而言，这些发现支持EGCG和RA作为有前景的多靶点多酚类黑色素瘤治疗候选物。

引言

黑色素瘤是一种侵袭性皮肤癌，仍然是全球主要的健康问题，导致高发病率和死亡率[1]。2022年，世界卫生组织（WHO）报告全球新增病例超过32.5万例，死亡人数约为5.7万例，这凸显了有效治疗策略的迫切需求[2]。黑色素瘤起源于产生黑色素的黑色素细胞，具有向远处器官转移的强烈倾向，因此早期发现和靶向治疗至关重要[3]。临床上，黑色素瘤表现为边界不规则的不对称病变，色素沉着程度不一，大小或形状也会发生变化。它可能起源于已存在的痣，也可能在正常皮肤上发展，这使得准确诊断变得困难。先进的诊断技术，如皮肤镜检查、皮肤活检和影像学检查，对于检测黑色素瘤及其分期至关重要[4]。 目前黑色素瘤的治疗方法多种多样，取决于肿瘤的分期和分子特征。对于局部病变，手术切除是主要的治疗方法；而对于晚期黑色素瘤，则采用包括化疗、免疫疗法、放疗和靶向疗法在内的系统治疗[5]。B-raf基因的突变（尤其是V600E突变）在大约50%的黑色素瘤中被发现，这些突变会激活MAPK信号通路，从而驱动肿瘤生长[6]。 在过去的二十年里，几种针对B-raf（B-raf快速加速纤维肉瘤）和MEK（有丝分裂原活化蛋白激酶）的抑制剂获批使用，显著改善了黑色素瘤的治疗效果[7]、[8]。著名的B-raf抑制剂，如维莫瑞芬（Vemurafenib，2011年）、达布法尼布（Dabrafenib，2013年）和恩科拉芬布（Encorafenib，2015年），被广泛用于治疗B-raf（BRAF V600E/K）突变的黑色素瘤[9]。与MEK抑制剂（如DS03090629、特拉梅替尼布（Trametinib，2013年）和科米替尼布（Cobimetinib，2015年）联合使用时，这些抑制剂通过结合ATP结合位点抑制MEK1/2，阻止MEK的激活和下游MAPK通路的信号传导，从而阻断肿瘤生长，提高治疗效果并克服耐药性[10]。此外，免疫疗法（如帕博利珠单抗（Pembrolizumab）、尼伏鲁单抗（Nivolumab）和伊匹木单抗（Ipilimumab）通过靶向免疫检查点，显著改善了黑色素瘤患者的生存率[11]。然而，对这些疗法的耐药性仍然是一个挑战，需要探索替代或补充的治疗策略。 多酚类化合物，包括黄酮类和非黄酮类化合物，因其抗氧化、抗炎和抗癌特性而在黑色素瘤治疗中受到关注[12]。这些天然化合物通过调节关键分子通路（如MAPK和PI3K/Akt通路）来抑制黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[13]。研究表明，黄酮类化合物（如槲皮素、儿茶素和山柰酚）能够通过直接影响这些通路发挥显著的抗癌作用[14]。黄酮类化合物分为多个亚类，包括黄烷醇（如槲皮素、没食子单宁）、黄酮（如木犀草素、芹菜素）和黄酮酮（如橙皮苷），每种化合物在抑制黑色素瘤进展方面都有独特的机制[15]、[16]。非黄酮类多酚（如白藜芦醇、姜黄素和咖啡酸）也表现出良好的抗癌活性，通过诱导细胞凋亡、增强化疗效果和减少肿瘤生长[17]、[18]。这些多酚类化合物作为天然的化学预防剂，为传统疗法提供了潜在的补充手段，同时减少了毒性和副作用。 基于结构的分析揭示了多酚类化合物对BRAF和MEK细胞内蛋白激酶的抑制机制，这是黑色素瘤研究中一个关键但尚未充分探索的领域[19]。虽然之前的研究主要集中在多酚类的抗氧化、抗炎或一般抗增殖作用上，但对它们在MAPK通路中直接、同时调节关键致癌激酶的机制理解仍然有限[20]、[21]。特别是，不同类别的多酚类化合物（如黄酮类EGCG和非黄酮类RA）与BRAF和MEK的多靶点相互作用，在分子和动态水平上尚未得到系统性的阐明。在本研究中，我们证明了这些多酚类化合物能够与BRAF和MEK的特定催化和别构残基结合，形成稳定的构象，从而破坏激酶活性并减弱导致黑色素瘤细胞存活、增殖和转移的下游信号通路。 与以往主要依赖于体外细胞毒性或单独对接分析的研究[22]、[23]不同，本研究结合了网络药理学、分子对接、分子动力学模拟、量子化学分析和实验细胞毒性验证，提供了对多酚类化合物作用于BRAF/MEK信号通路的全面、基于机制的评估。这种多层次的综合方法确定了EGCG和RA作为潜在的多靶点抑制剂的能力，能够解决单靶点激酶抑制剂常见的通路冗余和耐药性问题。因此，本研究的新颖之处不仅在于识别出EGCG和RA作为BRAF/MEK调节剂，还在于建立了支持其作为耐药性黑色素瘤辅助或替代治疗剂的机制和结构框架。基于多酚的策略可能为现有的黑色素瘤疗法提供一种更安全、多靶点且能缓解耐药性的补充方法。

材料

EGCG（纯度98%，目录编号E4143）购自Otto Chemie Pvt. Ltd.（印度孟买），而RA（纯度98%，目录编号R4033）由Himalaya Wellness Company（印度班加罗尔）免费提供。HPLC级甲醇、乙腈和甲酸购自HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.（印度孟买）。

干实验室研究的数据集预处理

基于结构化的文献调查和预定义的纳入标准，筛选出了42种多酚类化合物的库，以确保其科学相关性。

多酚类化合物与皮肤癌相关基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络

通过将80个常见靶点导入String数据库，进行了PPI（蛋白质-蛋白质相互作用）网络分析（见图S5）。所得PPI网络包含80个节点和1,026条边，平均节点度为25.6，平均局部聚类系数为0.677（见图S6）。MCODE聚类分析识别出参与皮肤癌治疗的关键蛋白质相互作用网络，突出了关键靶点和通路（见图S7）。聚类1（得分：23.938）代表一个高度互联的网络。

讨论

本研究全面探讨了多酚类化合物EGCG和RA在黑色素瘤中的抗癌潜力背后的分子机制。网络药理学分析表明，这两种化合物具有多靶点效应，与多个与黑色素瘤进展相关的关键蛋白质相互作用，包括BRAF、MEK、MAPK8、NRAS、GNAQ、GNA11、KRAS、PDGFRA、RTKs和PIK3CB。富集分析进一步强调了EGCG调控的关键通路。

结论

本研究对多酚类化合物EGCG和RA作为黑色素瘤中B-raf/MEK信号通路调节剂的潜力进行了综合计算和体外评估。使用STRING和Cytoscape进行的比较PPI分析确定了EGCG和RA可能通过的关键枢纽蛋白和功能簇，揭示了它们发挥抗癌作用的关键靶点。通过网络药理学、基于结构的建模和分子对接，这两种化合物的作用得到了进一步验证。

潜在利益冲突声明

作者们没有需要声明的利益冲突。