《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：DNA tetrahedron-radiated nanonetwork for the dual-mode detection of FEN1 and T4 PNK activities
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DNA四面体辐射纳米网络结合多阶段环介导扩增实现FEN1和T4 PNK高灵敏度双模式检测，荧光模式检测限4.58×10?3 U/mL，比色模式2.45×10?2 U/mL，并在细胞提取物中验证有效性。
崔万玲|李梦茹|牛梦颖|王瑞|吕恩光|乔梅|李伟|徐世才
中国山东省德州市德州大学生物物理研究所生物物理重点实验室，邮编253023
摘要
对FEN1和T4 PNK活性的敏感和准确检测对于癌症的早期诊断和治疗监测至关重要。在此，我们构建了一种基于多级滚环扩增（RCAs）的DNA四面体辐射纳米网络（DTRN），以实现FEN1和T4 PNK活性的敏感和双模式检测。具体来说，该设计包括一个具有四个第一级触发序列的DNA四面体纳米探针，用于第一级RCAs；识别元件和作为RCA模板的环状底物；以及一个具有多级触发序列的发夹探针，用于多级RCAs。最初，FEN1或T4 PNK特异性识别事件引发了连接反应，从而激活了第一级RCAs，合成了具有重复序列的长单链DNA。通过识别这些重复序列，发夹探针启动了多部位的第二级RCAs，并进一步激活了多级RCAs。最终，许多触发序列从不同位置同时延伸，形成了以DNA四面体为中心的纳米网络，同时产生了用于量化的荧光和紫外-可见光吸收信号。DTRN系统通过在DNA四面体上进行的多级RCAs实现了扩增效率的指数级提升，提高了检测灵敏度。在荧光模式下，FEN1的检测限低至4.58×10?3 U/mL?1，T4 PNK的检测限低至5.76×10?4 U/mL?1；在比色模式下，FEN1的检测限为2.45×10?2 U/mL?1，T4 PNK的检测限为3.75×10?3 U/mL?1。此外，双模式检测促进了相互验证和互补，提高了检测准确性。此外，在细胞提取物中成功检测到这两种酶的活性，证实了DTRN系统是一种高效的检测工具。
引言
Flap内切酶1（FEN1）和T4多核苷酸激酶（T4 PNK）是核酸代谢和修复酶，在维持基因组稳定性方面起着重要作用[1]、[2]。FEN1通过修复DNA复制过程中的 flap结构来保持复制保真度[3]，而T4 PNK通过修饰核酸末端来间接保证核酸完整性，从而促进受损核酸的修复[4]。这些代谢和修复酶的异常活性，即FEN1和T4 PNK，与癌症发病机制有关。FEN1和T4 PNK被视为有前景的癌症生物标志物和治疗靶点[5]。为了探索这些酶的生物学功能及其与疾病的关系，已经构建了多种方法来检测酶活性，包括传统的凝胶电泳[6]、[7]和Western blot[8]方法，以及荧光[9]、[10]、比色[11]、[12]、电化学[13]、[14]和电化学发光[15]、[16]等生物传感方法。
由于荧光方法操作简单、灵敏度高、检测速度快，因此一直被用于FEN1和T4 PNK活性的检测。在这种方法中，荧光探针在被FEN1特异性切割或经过T4 PNK特异性磷酸化引发的切割反应后被激活，从而实现目标的有效检测[17]、[18]。将荧光探针与DNA动态自组装技术和酶辅助扩增技术相结合，显著提高了FEN1和T4 PNK活性的检测灵敏度。然而，涉及催化发夹自组装[19]和杂交链反应[20]、[21]的DNA动态自组装技术容易发生非特异性反应，导致背景信号较高。同时，反应过程依赖于荧光探针的随机碰撞，导致反应速率低和扩增效率低。相比之下，酶辅助扩增技术具有显著高的信号扩增效率和优异的靶向特异性，已被应用于T4 PNK和FEN1活性的检测[9]、[10]、[22]、[23]、[24]、[25]。然而，这些方法通过利用分散的荧光探针与目标之间的特异性相互作用产生的扩增信号来实现目标检测。分散的荧光探针容易受到核酸酶降解和环境因素的影响，存在抗干扰能力差、信号稳定性低、靶向结合效率低等局限性，最终限制了检测的准确性和灵敏度。值得注意的是，精确调控溶液中分散的荧光分子的数量和位置仍然具有挑战性，导致信号输出的一致性和可控性较差。
DNA纳米结构是通过“自下而上”的组装策略利用DNA分子的固有性质构建的纳米级架构[26]、[27]。DNA纳米结构完美继承了DNA分子的优势，特别是高可编程性和优异的生物相容性，使其在生物医学、纳米技术和生物传感领域具有广泛的应用前景[28]。特别是DNA四面体是一种典型且最简单的三维纳米结构，具有四个顶点和六条臂，最初由Turberfield报道[29]。它基于Watson-Crick碱基互补配对原理由四条DNA链组装而成[30]，具有出色的机械刚性、丰富的功能修饰特性和抗核酸酶降解能力[31]。通过在DNA四面体的四个顶点或六条臂上修饰识别元件和信号元件，构建了用于检测小分子、核酸和酶活性的功能性DNA四面体探针[32]、[33]、[34]。例如，Jia等人修改了DNA四面体顶点的捕获探针和适配体，构建了一种用于piRNA成像的可激活DNA四面体纳米探针[35]。Wen等人修改了DNA四面体顶点的适配体和脱嘌呤/脱嘧啶内切酶1位点，构建了一种用于肿瘤中ATP特异性成像的酶控DNA四面体纳米探针[36]。通过将信号放大技术与DNA四面体纳米探针结合，检测灵敏度得到了提高[37]、[38]、[39]。DNA四面体系统的信噪比提高了十倍甚至数十倍，检测限降低了一个或两个数量级。这是因为DNA四面体上修饰的多个识别元件同时与目标结合，“多价效应”增强了DNA四面体探针与目标之间的相互作用，提高了靶向结合效率。此外，DNA四面体探针的结构稳定性显著提高。DNA四面体上的丰富修饰位点增加了探针的局部浓度，增强了检测信号的绝对强度，使得从低丰度目标捕获信号变得更加容易，从而大大提高了生物传感器的检测灵敏度。
滚环扩增（RCA）是一种等温酶辅助扩增技术，使用环状模板作为“轨道”来聚合并产生具有重复序列的连续超长单链DNA[40]。RCA具有高特异性、高灵敏度和操作简便等优点，已广泛应用于小分子、核酸和蛋白质的检测[41]。级联扩增反应通过链引发的两次或多次连续反应逐步放大初始目标信号[42]。其核心机制是利用前一个反应的产物作为后续反应的触发器，从而在信号传递中形成级联效应，最终实现对极低丰度目标的高灵敏度检测。该反应系统不仅具有指数级扩增反应的高扩增效率，能够快速将微弱信号放大到可检测水平，还能有效避免非特异性信号的干扰，显著提高检测的特异性和准确性。凭借这些独特优势，级联扩增反应在生物检测领域展示了极其广泛的应用前景[43]、[44]。
在此，构建了一种创新的多级RCAs支持的DNA四面体辐射纳米网络（DTRN），用于FEN1和T4 PNK活性的敏感和双模式检测。首先，在DNA四面体的四个顶点对FEN1或T4 PNK的第一级RCA触发序列和识别元件进行了功能修饰。一旦识别元件被FEN1或T4 PNK特异性识别，就会引发连接反应，生成RCA模板。第一级触发序列在DNA四面体上启动第一级RCAs，合成了具有重复序列的长单链DNA。发夹探针与长单链DNA的多个重复序列杂交，释放出第二级触发序列，启动第二级RCAs。发夹探针与第二级RCAs的产物杂交，释放出下一级触发序列，启动下一级RCAs。最终，许多触发序列从不同位置同时延伸，形成了以DNA四面体为中心的纳米网络。与分散系统相比，DTRN系统表现出更高的效率，双模式检测促进了两种模式之间的相互验证和互补。此外，DTRN系统通过在DNA四面体上进行的多级级联RCAs实现了扩增效率的指数级提升，实现了高检测灵敏度。在荧光模式下，FEN1的检测限低至4.58×10?3 U/mL?1，T4 PNK的检测限低至5.76×10?4 U/mL?1；在比色模式下，FEN1的检测限为2.45×10?2 U/mL?1，T4 PNK的检测限为3.75×10?3 U/mL?1。此外，DTRN系统在细胞提取物中成功检测到了FEN1和T4 PNK的活性，证实了其在癌症早期诊断、治疗监测和药物疗效评估方面的巨大潜力。
试剂和设备
试剂和设备的详细信息见支持资料。
功能化DNA四面体纳米探针（FDT）的组装
首先将五条DNA链（T1-T5或T1’-T5′，DNA序列见支持资料中的表S1）以相同的摩尔浓度（1 μM）混合在TM缓冲液中。将混合物加热至95°C 10分钟，然后逐渐冷却至4°C 2小时，从而形成了具有四个识别元件和第一级RCA触发序列的坚固FDT。
FEN1和T4 PNK活性检测
首先，将100 nM FDT与
DTRN的工作原理
DTRN用于FEN1和T4 PNK活性的敏感和双模式检测的工作原理如图1所示。最初，五条DNA链（T1、T2、T3、T4和T5或T1’、T2’、T3’、T4’和T5’）通过退火自组装形成FDT。第一级触发序列位于FDT的四个顶点，以启动第一级RCAs，这些触发序列最初由T5或T5’封闭。第一级触发序列与T5杂交形成分支
结论
总之，构建了一种创新的DTRN。以DNA四面体为中心，通过多级RCAs向外辐射形成了DTRN。DTRN系统将多级RCAs与DNA四面体结合，实现了输出信号的高效整合。凭借高扩增效率，DTRN系统实现了FEN1和T4 PNK活性的敏感检测。通过双模式检测的相互验证和互补，提高了检测
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了山东省自然科学基金（ZR2022MC054、ZR2024QH631）、国家自然科学基金（82403694、62301110、12274058）、山东省科技创新计划（2024KJG072）以及“一带一路”外国专家创新人才交流计划（DL2023023007L）的支持。
