Azoarcus pre-tRNAIle中I组内含子的剪接前构象与分步环化机制

《Nature Communications》：Pre-splicing conformation and stepwise circularization of a group I intron in Azoarcus pre-tRNA

这项研究旨在阐明具有催化能力的I组内含子RNA在剪接与环化过程中的完整三维结构动态。研究人员利用冷冻电镜技术，解析了Azoarcus pre-tRNAIle在剪接关键阶段的结构，包括全长前体（Pre-1S构象）、线性内含子及环状内含子，分辨率达2.8-3.3 ?。结果揭示了剪接过程中P1螺旋的预形成、碱基对滑动注册（register shift）以及G37构象翻转稳定环化位点等关键结构特征，并结合生化实验证实了一个两步环化机制，通过替代连接位点产生次级环化产物。该工作为理解RNA构象动力学、催化机理及环状RNA形成提供了原子层面的见解，对核酶工程具有广泛意义。

　　

RNA世界充满了令人惊叹的分子机器，其中I组内含子（Group I intron）堪称明星。它们是一类能够自我剪接、具有催化活性的RNA片段，无需蛋白质帮助就能将自己从RNA前体中精确切除。理解这类核酶（ribozyme）如何工作，不仅关乎生命起源的奥秘，也对设计新型RNA工具和 therapeutics 至关重要。然而，长期以来，科学家对这类复杂RNA的认知存在一个关键盲区：我们能看到剪接后产物的高清结构，但对于剪接发生前，完整的前体RNA长什么样、在三维空间中如何折叠以准备催化，以及剪接后产物如何进一步环化成稳定的环状RNA（circular RNA），一直缺乏原子层面的清晰图像。特别是环状RNA的形成机制，是近年来的研究热点，但其结构基础在I组内含子中几乎空白。

为了填补这些知识空白，一项发表在《Nature Communications》上的研究为我们揭开了谜底。研究人员将目光投向了来自细菌Azoarcus的 pre-tRNA^Ile系统。该系统包含一个I组内含子，是研究RNA剪接和催化的经典模型。研究者们利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）这一强大的结构生物学工具，捕捉了该RNA系统在剪接与环化关键阶段的“快照”，分辨率高达2.8-3.3埃，从而得以在原子水平上观察整个过程的动态演变。

本研究主要依托冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析技术，解析了不同功能状态的RNA复合物结构。研究样本为体外转录制备的Azoarcus pre-tRNA^IleRNA，通过控制反应条件，分别获得了代表剪接前状态的全长前体RNA、剪接后释放的线性内含子、以及环化反应中产生的两种环状内含子产物，用于后续的结构解析与生化分析验证。

全长前体呈现Pre-1S构象并揭示预形成的催化核心

研究人员首先解析了全长pre-tRNA^Ile前体的结构。这个结构代表的是剪接发生前的“预备”状态，被称为Pre-1S构象。令人惊讶的是，尽管剪接尚未发生，但内含子的催化核心区域已经基本折叠成熟，处于“待命”状态。其中，由外显子与内含子边界序列形成的P1螺旋是关键底物之一，研究发现这个P1 helix在pre-tRNA的背景下是预先形成的，而不是在结合催化核心后才诱导形成的。这为了解I组内含子如何识别并结合其剪接位点提供了新的结构视角。

剪接伴随碱基对注册滑动与关键鸟嘌呤的构象翻转

通过比较不同状态的结构，研究揭示了剪接过程中精细的结构变化。其中一个关键发现是“注册滑动”（register shift）现象。在剪接反应的第一步（即5‘剪接位点水解）发生后，连接外显子与内含子的碱基对相互作用会发生滑动，重新排列，这可能为第二步转酯反应（3‘剪接位点攻击）做好了准备。另一个至关重要的发现涉及位于催化口袋附近的一个高度保守的鸟苷酸G37。在从线性内含子到环状内含子的转变过程中，G37的碱基发生了显著的构象翻转。这一翻转使其能够与环化连接位点附近的核苷酸形成新的稳定相互作用，如同一个“分子开关”，锁定了环化产物的结构。

两步环化机制与替代连接位点的发现

研究最大的亮点之一是阐明了内含子从线性到环化的具体步骤。研究人员不仅解析了主要环化产物的结构，还意外地发现并解析了另一种环状内含子的结构。生化分析证实，环化过程分为两步：第一步，线性内含子在其标准的3‘末端进行分子内攻击，形成常见的、通过3‘-5‘磷酸二酯键连接的环状产物（称为L-19体）。第二步，这个初级环状产物可以发生进一步的重排，在一个替代的、内部的连接位点（文章中称为“替代连接位点”）进行二次连接，产生一个更小的、结构不同的次级环状产物。这种两步环化机制此前未被详细阐明，扩大了对RNA环化反应多样性的认识。

研究结论与意义

综上所述，这项工作通过高分辨冷冻电镜结构，结合生化验证，完整描绘了Azoarcus I组内含子从剪接前到剪接后，再到环化产物的结构演变路径。它揭示了几个核心结构原理：1. 在pre-tRNA中，催化核心和关键底物P1螺旋可预折叠形成；2. 剪接过程涉及精细的注册滑动和关键核苷酸（如G37）的构象重排；3. 环化是一个多步骤过程，存在通过替代位点进行二次连接的途径，展现了RNA反应的复杂性与可塑性。

这项研究的科学意义深远。它首次提供了I组内含子全长前体以及环化产物的高分辨率结构，将RNA剪接与环化的动态过程以原子电影的形式呈现出来。所揭示的构象变化，如G37的翻转，为理解RNA催化的精确调控提供了分子机制。发现的替代环化途径表明，天然核酶具有产生结构多样性产物的潜力，这为人工设计核酶和合成生物学应用提供了新思路。更重要的是，该研究建立了一套研究复杂RNA动态过程的方法学框架，对于探索其他非编码RNA的功能、环状RNA的生成与调控，乃至基于RNA的原始生命活动，都具有广泛的启示作用。